Biomaterials：3D打印構(gòu)建2型糖尿病體外皮膚模型

來源： EFL生物3D打印與生物制造

皮膚健康問題是2型糖尿病的首發(fā)可見癥狀。2型糖尿病可導(dǎo)致一系列的皮膚問題，比如：糖尿病皮膚病、水泡、皮疹、瘙癢和真菌感染等。這種情況發(fā)生在機(jī)體對胰島素?zé)o法正常反應(yīng)或不能產(chǎn)生足夠的胰島素來維持正常的血糖水平時。特別是長期糖尿病并發(fā)癥合并高血糖狀態(tài)。進(jìn)入皮膚的血液循環(huán)減少會損害細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致自我修復(fù)困難。由于傷口愈合的延遲，皮膚損傷的糖尿病人患者具有高感染風(fēng)險。14% - 24%的患者需要截肢，其中85%是在腳底(稱為糖尿病足潰瘍)。盡管如此嚴(yán)重，據(jù)報道糖尿病相關(guān)的皮膚病仍然沒有很好的治療方法。

前人主要應(yīng)用糖尿病動物模型來進(jìn)行糖尿病皮膚病的研究，但是動物模型的倫理問題以及動物基因組與人類基因組的差異導(dǎo)致該模型并不能十分合理的預(yù)測其方法的準(zhǔn)確性。近期，來自韓國浦項科技大學(xué)的Dong-Woo Cho教授團(tuán)隊在Biomaterials上發(fā)表了題目為Engineering of diseased human skin equivalent using3D cell printing for representing pathophysiological hallmarks of type 2diabetes in vitro的文章，應(yīng)用3D打印技術(shù)體外構(gòu)建了具有糖尿病病理特征的皮膚模型。

盡管已有許多關(guān)于體外構(gòu)建皮膚模型的成果，但未有人報道過體外皮膚疾病模型。因此，研究人員通過3D細(xì)胞打印主要皮膚層(表皮、真皮層、皮下組織和血管)和利用天然皮膚中發(fā)現(xiàn)的生理現(xiàn)象來建模具有明確2型糖尿病屬性的患病皮膚。圖1顯示了這項研究的一些重點和工作流程。

圖1 本研究的一些重點和工作流程

盡管3D皮膚打印技術(shù)已取得了許多重大進(jìn)展，但尚未有皮膚病理模型報道。因此，研究人員基于3D細(xì)胞打印技術(shù)在體外建立具有2型糖尿病病理生理特征的3D病變皮膚組織。為了克服糖尿病角質(zhì)形成細(xì)胞分化能力差的問題，研究人員利用在天然皮膚中發(fā)現(xiàn)的表皮-真皮胞間通訊的作用，假設(shè)糖尿病成纖維細(xì)胞(dHDFs)可以誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞(nHEKs)成為糖尿病型表皮細(xì)胞。為了證明這一假設(shè)，研究人員分離dHDFs，并從組織學(xué)和基因表達(dá)的角度進(jìn)行分析。研究人員首次將可打印聚己內(nèi)酯(PCL)納入3D細(xì)胞打印的損傷皮膚模型中，使之成為一個3D transwell系統(tǒng)。在糖尿病皮膚模型中觀察到糖尿病皮膚的重要特征：延遲再上皮化。為了進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)構(gòu)相似性和糖尿病特性，該研究在真皮層下面添加了含有糖尿病人脂肪細(xì)胞和可灌注血管通道的皮下層。在該糖尿病皮膚模型中發(fā)現(xiàn)了胰島素抵抗增加、血管功能障礙、脂肪肥大和促炎癥反應(yīng)等糖尿病特征。最后，為了證明構(gòu)建的糖尿病皮膚在皮膚病學(xué)研究和藥物測試方面的潛在應(yīng)用，研究人員將試驗藥物（二甲雙胍/EPA）應(yīng)用于血管通道3天。觀察表皮的功能恢復(fù)和炎癥反應(yīng)的減少。

圖2分析dHDFs與nHDFs細(xì)胞之間的差異：nHDFs較dHDFs的遷移能力強(qiáng)，COL I表達(dá)量更高。

圖3 利用3D打印技術(shù)結(jié)合PCL小室構(gòu)建正常皮膚模型和糖尿病皮膚模型：圖A-B顯示成熟3D皮膚模型及其HE染色結(jié)果，據(jù)統(tǒng)計，糖尿病皮膚的表皮厚度較正常皮膚模型表皮厚度薄1.52倍；圖D利用基因分析技術(shù)統(tǒng)計了分化標(biāo)記物(K10: keratin10, IVL: involucrin) 和糖尿病相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)量之間的差異(IR: Insulin receptor,TNF-α: tumor necrosis factor-alpha)，符合糖尿病皮膚的蛋白表達(dá)狀態(tài)；圖E結(jié)果顯示，由dHEKs和dHDFs組成的皮膚模型的接觸角(測量值約為21°)與糖尿病皮膚模型的接觸角(測量值約為19°)沒有差異；圖F-H表明糖尿病模型創(chuàng)口恢復(fù)能力延遲，符合糖尿病皮膚特征。

圖4 應(yīng)用同軸擠出打印方式在3D打印糖尿病皮膚模型中添加血管結(jié)構(gòu)，并在結(jié)構(gòu)下方增加皮下脂肪層結(jié)構(gòu)：圖A顯示整體打印流程；圖B顯示灌流過程；圖C顯示其內(nèi)部形成的血管結(jié)構(gòu)；圖D顯示葡萄糖攝取結(jié)果，糖尿病皮膚模型有胰島素抵抗現(xiàn)象；圖E顯示在高糖狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞中脂滴更大；圖F顯示不同糖濃度培養(yǎng)條件下TNF-α、IL-6、ROS的表達(dá)量隨時間逐漸增加，高糖環(huán)境三者的表達(dá)量更高；圖G表示 FITC標(biāo)記的右旋糖酐注入血管流道10分鐘。熒光圖像顯示高糖狀態(tài)下糖尿病皮膚模型較正常皮膚模型具有較低擴(kuò)散滲透性。這表明內(nèi)皮屏障將被建立的高血糖條件削弱。該模型可以通過高血糖條件進(jìn)一步反映糖尿病的主要特性，包括脂肪細(xì)胞萎縮、血管功能障礙、炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗。

圖5 糖尿病皮膚模型的潛在應(yīng)用探索。將二甲雙胍或二十碳五烯酸（EPA）通過血管組織進(jìn)行灌流操作；機(jī)制層面：由于鞘糖脂累積，糖尿病角質(zhì)細(xì)胞層的胰島素受體（IR）會關(guān)閉。圖C共聚焦圖片顯示胰島素受體磷脂（p-IR）在經(jīng)過二甲雙胍處理后與正常水平相似。圖D葡萄糖攝取實驗顯示實驗組中存在胰島素抵抗現(xiàn)象；圖E表示在EPA治療后糖尿病皮膚模型的炎癥反應(yīng)降低。

本文首次應(yīng)用3D打印技術(shù)構(gòu)建糖尿病皮膚模型，并通過胞間通訊的作用原理利用dHDFs將nHDFs誘導(dǎo)成為dHDFs，使之成為與糖尿病患者皮膚類似的體外病理模型。通過添加皮下脂肪層與血管結(jié)構(gòu)構(gòu)建灌流通道，為后續(xù)藥物評估建立便捷條件。增強(qiáng)的糖尿病皮膚模型包括糖尿病的典型特性，如胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞肥大、炎癥反應(yīng)和血管功能障礙。此外，研究人員通過將糖尿病相關(guān)藥物導(dǎo)入皮膚模型的工程血管，驗證了其作為藥物篩選和新進(jìn)展的疾病模型的可行性。


文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120776