3D打印工程血管用于監(jiān)測單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用及藥物發(fā)現(xiàn)

來源：EFL生物3D打印與生物制造

動脈粥樣硬化早期，單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮是其重要特征，這一過程涉及多種細(xì)胞因子和病理事件。當(dāng)前評估單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的實驗通常依賴二維共培養(yǎng)模型，難以準(zhǔn)確呈現(xiàn)真實病理事件的時空特征。來自浙江大學(xué)的王毅、賀永教授與浙江中醫(yī)藥大學(xué)趙筱萍教授團(tuán)隊合作，利用EFL擠出式生物3D打印機(jī)，建立了一種3D打印工程血管（EBVs）監(jiān)測單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的新方法，以解決上述痛點(diǎn)。該團(tuán)隊通過同軸打印技術(shù)構(gòu)建了具有空心管狀結(jié)構(gòu)的EBVs，并對其進(jìn)行內(nèi)皮化處理，建立了單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附的體外模型，還驗證了該模型在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用價值。相關(guān)工作以《Coaxial 3D Printing of Blood Vessels for Monitoring Monocyte-Endothelium Interactions and Drug Discovery》為題發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》上。

圖1. 用于建立單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附三維模型及藥物測試的同軸打印工程血管（EBVs）示意圖。

研究內(nèi)容
1. 工程血管的制備與表征圖，通過同軸打印、光交聯(lián)及明膠溶解的研究方法，制備了工程血管（EBVs），并對其內(nèi)徑、外徑及表面形態(tài)進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，EBVs呈空心管狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)徑約1.2 mm，外徑約3.1 mm，管壁具有多孔結(jié)構(gòu)，適合細(xì)胞培養(yǎng)和藥物暴露。

圖2. 工程血管的制備與表征圖。  

2. 工程血管內(nèi)皮化及生物活性表征圖，通過細(xì)胞接種、免疫熒光染色及細(xì)胞活性檢測等研究方法，對EBVs進(jìn)行內(nèi)皮化處理并評估其生物活性。結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞在EBVs內(nèi)形成了致密的細(xì)胞層，具有較高的細(xì)胞活力和代謝活性，且表現(xiàn)出類似血管內(nèi)皮的屏障功能和炎癥反應(yīng)功能。

圖3. 工程血管內(nèi)皮化及生物活性表征圖。  

3. 工程血管屏障功能和炎癥反應(yīng)功能圖，通過熒光素標(biāo)記葡聚糖擴(kuò)散實驗及ELISA等研究方法，研究了內(nèi)皮化EBVs的屏障功能和對腫瘤壞死因子α（TNFα）刺激的炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，內(nèi)皮化EBVs具有良好的屏障功能，且TNFα刺激可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1），并分泌可溶性ICAM-1（sICAM-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1），且呈劑量依賴性。

圖4. 工程血管屏障功能和炎癥反應(yīng)功能圖。  

4. 腫瘤壞死因子α濃度和THP-1細(xì)胞黏附時間優(yōu)化圖，通過不同濃度TNFα刺激及不同黏附時間處理的研究方法，優(yōu)化了單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附模型的條件。結(jié)果表明，TNFα濃度為10 ng/mL、黏附時間為60 min時，THP-1細(xì)胞黏附效果最佳，成功建立了單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附模型。

圖5. 腫瘤壞死因子α濃度和THP-1細(xì)胞黏附時間優(yōu)化圖。  

5. 不同藥物抑制單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附的活性評估圖，通過藥物處理及細(xì)胞黏附計數(shù)的研究方法，評估了川芎揮發(fā)油（CX oil）、 ligustilide和eupalinilide B對TNFα誘導(dǎo)的單核細(xì)胞黏附的抑制作用。結(jié)果表明，這三種藥物均能顯著抑制單核細(xì)胞黏附，且細(xì)胞毒性較低，驗證了模型在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用價值。

圖6. 不同藥物抑制單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附的活性評估圖。  

6. 不同藥物對ICAM-1表達(dá)及sICAM-1、IL-6、MCP-1分泌的影響圖，通過免疫熒光染色及ELISA的研究方法，研究了藥物對炎癥相關(guān)因子的影響。結(jié)果表明，TPCA-1和eupalinilide B可同時抑制ICAM-1表達(dá)和sICAM-1分泌，CX oil和ligustilide僅抑制sICAM-1分泌，且所有藥物均能抑制IL-6和MCP-1分泌。

圖7. 不同藥物對ICAM-1表達(dá)及sICAM-1、IL-6、MCP-1分泌的影響圖。  

7. 不同藥物對脂多糖誘導(dǎo)的斑馬魚卵黃巨噬細(xì)胞聚集的影響圖，通過建立斑馬魚炎癥模型及藥物處理的研究方法，驗證了藥物的體內(nèi)抗炎活性。結(jié)果表明，CX oil、ligustilide和eupalinilide B均能顯著減少斑馬魚卵黃區(qū)巨噬細(xì)胞聚集，表明模型評估的藥物活性與體內(nèi)結(jié)果一致。

圖8. 不同藥物對脂多糖誘導(dǎo)的斑馬魚卵黃巨噬細(xì)胞聚集的影響圖。

研究結(jié)論
本研究利用同軸打印的工程血管（EBVs）作為支架，對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)以構(gòu)建均勻的內(nèi)皮層。內(nèi)皮化后的EBVs可作為研究單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮以及發(fā)現(xiàn)抑制單核細(xì)胞黏附藥物的有價值工具。研究結(jié)果顯示，川芎揮發(fā)油及其主要成分川芎嗪和紫莖澤蘭內(nèi)酯B能顯著抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的單核細(xì)胞黏附，其中紫莖澤蘭內(nèi)酯B的這一活性為首次報道。此外，利用內(nèi)皮化EBVs進(jìn)行的藥物測試結(jié)果與脂多糖誘導(dǎo)的斑馬魚巨噬細(xì)胞聚集模型的結(jié)果一致。本研究展示了使用同軸打印血管模型評估天然植物化學(xué)物質(zhì)對單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附抑制作用的典型案例，可能有助于推動3D打印技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用。
文章來源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202404132