適配組織粘彈性的生物3D打印墨水可調(diào)控負(fù)載細(xì)胞行為并增強(qiáng)生物學(xué)功能

來源：EngineeringForLife

3D生物打印技術(shù)通過將細(xì)胞精準(zhǔn)包裹于凝膠相材料中進(jìn)行定向沉積，既能構(gòu)建具有定制幾何形態(tài)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，又能為細(xì)胞提供必要的力學(xué)支撐。這一尖端技術(shù)在個性化醫(yī)療、藥物研發(fā)、類器官工程等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力，未來或?qū)⒊蔀獒t(yī)療生物制造領(lǐng)域的關(guān)鍵產(chǎn)業(yè)。為優(yōu)化打印組織的功能性，需在打印過程及后續(xù)培養(yǎng)中全程調(diào)控細(xì)胞行為。目前研究主要通過優(yōu)化水凝膠可打印性，輔以載藥或添加活性因子等生化策略來增強(qiáng)細(xì)胞性能。但最新證據(jù)表明，調(diào)控水凝膠的剛度、孔隙率、表面粗糙度等力學(xué)特性，同樣能顯著影響細(xì)胞行為與生物學(xué)功能。開發(fā)兼具打印保真度與細(xì)胞功能性的生物材料，仍是擠出式3D生物打印領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)。


來自蘇州大學(xué)的李斌等團(tuán)隊提出一種小分子介導(dǎo)動態(tài)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的粘彈性水凝膠，其可通過精確調(diào)控粘彈特性模擬多種組織的力學(xué)性能。該水凝膠憑借高粘度與快速剪切稀化的獨特組合，在保持結(jié)構(gòu)完整性的同時顯著降低擠出過程對細(xì)胞的損傷。其中模擬骨髓粘彈性的水凝膠通過整合素/p-FAK/Lamin/YAP信號通路，在3D培養(yǎng)中顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、鋪展、遷移及干性維持，并在體外和體內(nèi)實驗中均展現(xiàn)出增強(qiáng)的骨再生效果。研究還揭示了粘彈性水凝膠介導(dǎo)成骨分化的分子機(jī)制，首次發(fā)現(xiàn)Wnt1與YAP在細(xì)胞核內(nèi)共定位并相互作用的新現(xiàn)象。此外，通過復(fù)現(xiàn)與結(jié)腸癌、肺纖維化及肝癌相關(guān)的病理基質(zhì)力學(xué)參數(shù)，該粘彈性水凝膠可成功構(gòu)建疾病模型。這項工作為生物墨水設(shè)計建立了創(chuàng)新策略，通過將可調(diào)控粘彈性與生物功能相融合，為再生醫(yī)學(xué)與疾病建模提供了統(tǒng)一平臺，展現(xiàn)出廣闊的3D生物打印轉(zhuǎn)化前景。相關(guān)工作以題為“Tailored Hydrogels for 3D Bioprinting: Matching Tissue Viscoelasticity to Enhance Resident Cell Functionality”的文章發(fā)表在2025年05月19日的期刊《Advanced Functional Materials》。

【匹配組織粘彈性的水凝膠構(gòu)建及其3D打印性能評估】

在本研究團(tuán)隊前期工作中，開發(fā)了一種基于小分子的創(chuàng)新策略，可制備儲能模量（G′）與損耗模量（G″）獨立可調(diào)的粘彈性水凝膠。該體系由甲基丙烯?；髂z（GelMA）、苯硼酸修飾明膠（GP）和3,4-二羥基苯甲醛（DB）組成。在中性pH條件下，三者通過物理混合形成硼酸酯鍵與希夫堿鍵的動態(tài)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，其快速解離-重組動力學(xué)主導(dǎo)水凝膠的損耗模量；而后續(xù)紫外光引發(fā)GelMA共價交聯(lián)則主要調(diào)控儲能模量。通過調(diào)整各組分配比，我們制備了五種粘彈性水凝膠（Gel1-Gel5），其模量參數(shù)可精準(zhǔn)匹配肺、結(jié)腸、皮膚、骨髓及肝臟等組織的力學(xué)特性（圖1A）。目標(biāo)組織的參考粘彈性參數(shù)通過文獻(xiàn)調(diào)研或流變測試獲得[27]，其中Gel1儲能模量最低（0.32 kPa），損耗因子（Tanδ）為0.15，與肺組織特征高度吻合；而Gel5儲能模量較高（2.05 kPa），損耗因子降至0.12，模擬了肝臟的力學(xué)特性。這些結(jié)果證實了該水凝膠構(gòu)建策略在復(fù)現(xiàn)組織特異性力學(xué)參數(shù)方面的巨大潛力，為研究粘彈性及其變化對組織生理病理的影響提供了理想平臺。

圖1 匹配多組織黏彈性的水凝膠制備及其可打印性評估

【模擬骨髓粘彈性的水凝膠3D生物打印】

在擠出式3D生物打印中，追求高打印分辨率常以犧牲細(xì)胞活性為代價。尤其是針尖直徑與注射器內(nèi)徑的巨大差異會產(chǎn)生顯著速度梯度，導(dǎo)致剪切應(yīng)力峰值遠(yuǎn)超生理水平，可能引發(fā)細(xì)胞變形、膜破裂甚至死亡。即使細(xì)胞存活，這種機(jī)械損傷也會影響后續(xù)培養(yǎng)中的活性和生物學(xué)功能?；谇捌谧C實10GP水凝膠的優(yōu)異打印性能，本文推測其快速剪切稀化特性可緩解擠出過程中的細(xì)胞損傷。為驗證該假設(shè)，本文將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分別載入10GP與10G水凝膠，并對擠出后的支架細(xì)胞進(jìn)行即時凋亡染色。結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞主要分布在擠出絲狀體的邊緣區(qū)域，即水凝膠-針壁界面處（圖2A,B），證實細(xì)胞損傷確實源于流動水凝膠與靜止針壁間的速度差。

本文通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析并設(shè)立空白對照組（排除基礎(chǔ)低活性干擾），選擇擠出后6小時檢測（避免長時間非培養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致的營養(yǎng)缺乏混雜效應(yīng)）。對照組僅檢測到微量凋亡，而10G組凋亡率達(dá)23.94%，約為10GP組的兩倍（圖2C,E）。這一發(fā)現(xiàn)表明：盡管10GP初始粘度更高，但其快速剪切稀化能力可大幅降低水凝膠邊緣的局部粘度，有效潤滑針壁并提供細(xì)胞保護(hù)，從而減少擠出過程中的細(xì)胞損失。

圖2 10G與10GP3D打印中BMSCs的凋亡、活性及干性研究

【黏彈性水凝膠對細(xì)胞行為的調(diào)控研究】

本文將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分別包封于10GP與10G水凝膠中培養(yǎng)3天。5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）染色及定量分析顯示，10GP組的BMSCs增殖率顯著高于10G組（圖3A,B），這表明10GP水凝膠可能為BMSCs的定植與擴(kuò)增提供了更有利的微環(huán)境，從而加速組織構(gòu)建進(jìn)程。通過F-肌動蛋白熒光染色觀察細(xì)胞骨架排布發(fā)現(xiàn)，兩組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)差異：10G水凝膠中的BMSCs主要保持圓形形態(tài)且鋪展受限，而10GP組細(xì)胞則展現(xiàn)出廣泛的鋪展行為，形成顯著的細(xì)胞突起與片狀偽足，整體呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形（圖3C,D）。這種形態(tài)轉(zhuǎn)變可歸因于10GP水凝膠的仿生黏彈性特性，其增強(qiáng)了細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。核形態(tài)計量學(xué)分析進(jìn)一步顯示，10GP組BMSCs的核面積顯著增大（圖3E）。這種核膨脹現(xiàn)象可能反映了細(xì)胞骨架重組和染色質(zhì)重塑對水凝膠機(jī)械微環(huán)境的響應(yīng)，進(jìn)而潛在調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性與細(xì)胞功能。

圖3 BMSCs在10G與10GP水凝膠中的細(xì)胞行為

【黏彈性水凝膠誘導(dǎo)的機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路】

具有仿生骨髓黏彈特性的水凝膠在促進(jìn)細(xì)胞存活、干性維持、增殖、鋪展及遷移行為方面展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。這些發(fā)現(xiàn)表明，精確模擬天然組織黏彈性可有效重建體外培養(yǎng)中細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的關(guān)鍵相互作用。作為結(jié)構(gòu)界面與核心機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐，細(xì)胞膜在ECM成分與胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)間發(fā)揮關(guān)鍵中介作用——通過多種膜受體選擇性識別并處理ECM來源的機(jī)械刺激。其中，整合素作為跨膜連接器將細(xì)胞骨架與膠原等ECM蛋白相連，建立細(xì)胞感知-響應(yīng)的核心機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。整合素β1作為整合素β亞基家族基本成員，通過膜定位后的構(gòu)象激活參與機(jī)械信號傳導(dǎo)，觸發(fā)級聯(lián)胞內(nèi)信號事件以調(diào)控黏附、遷移及機(jī)械感知等過程。

為闡明整合素β1及其下游通路響應(yīng)水凝膠黏彈性的作用機(jī)制，本文進(jìn)行了免疫熒光染色實驗，發(fā)現(xiàn)10GP組整合素β1活化水平顯著升高，伴隨明顯的細(xì)胞鋪展與骨架重組（圖4A,B）。黏著斑激酶（FAK）作為整合素β1通路的關(guān)鍵信號介質(zhì)，通過與整合素、紐蛋白形成黏著斑復(fù)合體，不僅橋接胞內(nèi)骨架與ECM，更在調(diào)控細(xì)胞黏附遷移中發(fā)揮核心作用。對磷酸化FAK（p-FAK）和紐蛋白的熒光染色定量分析表明，10GP組水凝膠的黏性耗散特性可上調(diào)p-FAK水平（圖4C）并誘導(dǎo)更廣泛的紐蛋白分布（圖4D），提示其增強(qiáng)了黏著斑組裝與機(jī)械感知活性。

圖4 BMSCs在10G與10GP中的生物力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

此外，本文探究了黏彈性水凝膠中機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞干性維持的關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)定量分析表明，抑制p-FAK會導(dǎo)致細(xì)胞干性標(biāo)志物表達(dá)降低（圖5A）。同樣，抑制下游蛋白YAP也會引起這些標(biāo)志物表達(dá)下降（圖5B）。這證實了本研究團(tuán)隊前期的發(fā)現(xiàn)：黏彈性水凝膠支架能夠支持BMSCs干性的維持?？傮w而言，當(dāng)在黏彈性水凝膠支架中培養(yǎng)時，BMSCs可將細(xì)胞膜接收的外部機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為生物信號，隨后通過整合素β1/p-FAK介導(dǎo)的機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞內(nèi)傳遞。當(dāng)核膜感知到來自支架的機(jī)械力時，核纖層蛋白A/C表達(dá)上調(diào)， YAP發(fā)生顯著的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞核活動以促進(jìn)BMSCs干性的維持（圖5C）。

圖5 10GP中p-FAK與YAP對BMSCs干性的關(guān)聯(lián)性分析

【3D打印粘彈性水凝膠支架中BMSC的成骨分化研究】
基于對粘彈性水凝膠打印過程中剪切稀化特性及其維持細(xì)胞功能關(guān)鍵作用的闡釋，本文通過評估3D打印粘彈性水凝膠中BMSC的成骨分化潛能，進(jìn)一步探究了其對組織再生的后續(xù)影響。將負(fù)載BMSC的水凝膠支架（10G、10GP）浸入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以驗證特定環(huán)境下BMSC定向分化是否增強(qiáng)。培養(yǎng)7天后，10GP組的堿性磷酸酶（ALP）活性較10G組顯著升高（圖6A）。14天后的茜素紅染色顯示10GP組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量更多（圖6B）。通過qRT-PCR分析兩組RNA發(fā)現(xiàn)，10GP組中Col1a1、Bglap、Runx2和Alpl基因表達(dá)均高于10G組。這些結(jié)果表明BMSC在體外粘彈性水凝膠支架中展現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨分化潛能。

另外，本文發(fā)現(xiàn)：力學(xué)信號通過激活Wnt等多條信號通路，在調(diào)控BMSC成骨分化、骨骼發(fā)育與重塑中起關(guān)鍵作用。然而水凝膠粘滯耗散特性介導(dǎo)YAP核轉(zhuǎn)位的具體分子機(jī)制仍有待闡明。為此，本文以粘彈性水凝膠為力學(xué)傳導(dǎo)研究平臺，旨在發(fā)現(xiàn)潛在通路或靶點。具體而言，將BMSC接種于粘彈性水凝膠中，經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，以YAP抗體為誘餌從細(xì)胞裂解液中分離互作蛋白并進(jìn)行質(zhì)譜分析。排除干擾蛋白后，基因本體（GO）富集分析顯示這些蛋白主要參與三大生物學(xué)過程：細(xì)胞代謝調(diào)控、物質(zhì)結(jié)合及蛋白質(zhì)復(fù)合物組裝（圖6C）。同步進(jìn)行的KEGG通路富集分析表明，與YAP互作的蛋白涉及"Wnt信號通路"、"真核生物核糖體生物合成"及"干細(xì)胞多能性調(diào)控通路"（圖6D），這些通路均有利于促進(jìn)成骨。

圖6 打印10G與10GP支架中BMSCs的成骨分化潛能

【3D打印粘彈性水凝膠支架的骨缺損修復(fù)研究】

為評估負(fù)載BMSC的粘彈性水凝膠支架體內(nèi)骨修復(fù)效果，本文采用大鼠顱骨缺損模型進(jìn)行實驗。在健康大鼠顱骨手術(shù)制備直徑≈5 mm、深度2 mm的標(biāo)準(zhǔn)化缺損，并將打印水凝膠尺寸按比例縮小以匹配骨缺損模型（圖7A）。植入4周后的Micro-CT掃描顯示各組修復(fù)效果差異顯著：對照組缺損區(qū)未見新骨形成且仍存在明顯空隙；10G組僅出現(xiàn)零星分散的新骨組織；而10GP組則表現(xiàn)出優(yōu)異的成骨能力，缺損邊緣形成連續(xù)環(huán)形新骨組織且整合良好，呈現(xiàn)明顯的向心性生長模式。至第8周時，10GP組新骨組織已向缺損中心區(qū)域延伸，僅殘留極小未愈合區(qū)；雖然10G組較基線有所改善，但仍有超半數(shù)缺損未覆蓋，修復(fù)效果顯著劣于10GP組（圖7B）。通過骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）及厚度（Tb.Th）的定量分析進(jìn)一步證實，10GP組的骨再生能力顯著優(yōu)于10G組（圖7C）。

圖7 打印10G與10GP支架的骨缺損修復(fù)效果

【粘彈性水凝膠構(gòu)建疾病模型的潛力研究】

基于前期研究，我們通過調(diào)整粘彈性水凝膠的組分濃度，成功模擬了三種非肌肉骨骼系統(tǒng)疾病相關(guān)組織的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）力學(xué)特性：結(jié)腸癌、肺纖維化和肝癌。如圖8A所示，這些病理基質(zhì)的儲能模量與損耗因子值均得到精確復(fù)現(xiàn)。三種水凝膠均表現(xiàn)出良好的可打印性，可負(fù)載相應(yīng)細(xì)胞打印出模擬結(jié)腸隱窩的管狀結(jié)構(gòu)、肺泡網(wǎng)絡(luò)的蜂窩狀圖案以及肝小葉構(gòu)型的3D支架，用于體外疾病模型構(gòu)建嘗試。在粘彈性結(jié)腸癌模型中，結(jié)腸癌細(xì)胞自發(fā)形成球狀細(xì)胞團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，該現(xiàn)象與其他腫瘤類器官研究結(jié)果一致。作為細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物，Ki-67已被證實與結(jié)腸癌進(jìn)展呈正相關(guān)，并廣泛用于結(jié)腸癌類器官的活性表征。實驗顯示相較于GelMA水凝膠，粘彈性水凝膠中的細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的Ki-67表達(dá)（圖8B），表明該體系能促進(jìn)結(jié)腸癌類器官的細(xì)胞增殖。

圖8 基于定制黏彈性水凝膠的病理力學(xué)微環(huán)境疾病模型構(gòu)建

【總結(jié)與展望】
本研究通過動態(tài)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)制備了儲能模量與損耗模量可獨立調(diào)控的粘彈性水凝膠，結(jié)合生物打印技術(shù)構(gòu)建高精度支架，成功開發(fā)出面向?qū)嶋H應(yīng)用需求的生物墨水。通過精準(zhǔn)匹配五種組織的粘彈性力學(xué)特征，并優(yōu)化水凝膠的初始黏度與剪切稀化特性，在保證打印精度的同時有效降低細(xì)胞損耗，一定程度解決了機(jī)械擠出式3D打印的關(guān)鍵難題。該粘彈性水凝膠在細(xì)胞活性、打印保真度和組織仿生性方面的突破，為深入理解細(xì)胞對粘彈性的響應(yīng)及生物材料科學(xué)發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。

參考資料：https://doi.org/10.1002/adfm.202503987