3D打印微流控平臺制備多孔納米纖維微球用于調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)及促進(jìn)組織再生

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在組織再生領(lǐng)域，多孔納米纖維微球（PNMs）因兼具仿生形貌、可調(diào)結(jié)構(gòu)與可注射性，成為極具潛力的微創(chuàng)治療策略，但傳統(tǒng)自組裝、同軸電噴霧等制備方法存在組成多樣性受限、生產(chǎn)率不足等問題，且微流控技術(shù)用于PNMs 制造的研究尚未被報道。美國內(nèi)布拉斯加大學(xué)醫(yī)學(xué)中心與內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校的Jingwei Xie教授團(tuán)隊開發(fā)出3D打印微流控平臺，實現(xiàn)了PNMs的大規(guī)模制備，并通過UV交聯(lián)對其進(jìn)行生物活性分子功能化，精準(zhǔn)調(diào)控PNMs的尺寸、孔隙結(jié)構(gòu)及形貌，顯著提升了其在促進(jìn)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成及巨噬細(xì)胞抗炎反應(yīng)等方面的再生潛力。相關(guān)工作以“3D-Printed Microfluidic Platform for Creating Porous Nanofibrous Microspheres to Regulate Cell Response and Enhance Tissue Regeneration”為題發(fā)表在《Small》上。

研究內(nèi)容
1. 肽共軛多孔納米纖維微球（PNMs）的制備流程及應(yīng)用示意圖，通過冷凍切割、靜電紡絲、3D打印微流控平臺結(jié)合UV交聯(lián)等方法，研究了PNMs的制備過程及其在調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)中的應(yīng)用，結(jié)果表明該平臺可大規(guī)模制備PNMs，且PNMs經(jīng)BMP-2、QK、AF-1肽功能化后能分別促進(jìn)成骨、血管生成及抗炎反應(yīng)。

圖1. 肽共軛PNMs的制備流程及應(yīng)用示意圖。  

2. 內(nèi)氣流速率（Qi）對PNMs形貌和尺寸的影響，通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同Qi（2-10 mL/min）下PNMs的結(jié)構(gòu)，研究了內(nèi)氣流對PNMs孔隙形成和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明Qi主要調(diào)控PNMs的孔隙數(shù)量和孔徑，當(dāng)Qi從2增至10 mL/min時，表面孔徑從約50 μm擴(kuò)大至250 μm，而微球直徑保持在800 μm左右。

圖2. 內(nèi)氣流速率對PNMs形貌和尺寸的影響。  

3. 外氣流速率（Qo）對PNMs形貌和尺寸的影響，利用SEM分析Qo在8-14 L/min范圍內(nèi)的變化效應(yīng)，研究了外氣流對PNMs內(nèi)部結(jié)構(gòu)、直徑（D）和孔隙特征的影響，結(jié)果顯示Qo增加使PNMs從多隔室結(jié)構(gòu)變?yōu)榭招慕Y(jié)構(gòu)，D從1200 μm減小至700 μm，孔隙數(shù)從15降至8，而孔徑保持穩(wěn)定。

圖3. 外氣流速率對PNMs形貌和尺寸的影響。  

4. 納米纖維懸浮液流速（Qs）對PNMs形貌和尺寸的影響，通過SEM觀察Qs在0.5-2 mL/min時的PNMs結(jié)構(gòu)，研究了懸浮液流速對PNMs內(nèi)部空間填充度、孔徑（Dpore）和孔隙數(shù)的影響，結(jié)果表明Qs增加導(dǎo)致內(nèi)部空間更密實，Dpore從180 μm減小至80 μm，孔隙數(shù)從6增至10，而微球直徑無顯著變化。

圖4. 納米纖維懸浮液流速對PNMs形貌和尺寸的影響。  

5. BMP-2、QK和AF-1肽共軛PNMs的表征，通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），研究了肽共軛效率及釋放動力學(xué)，結(jié)果顯示熒光標(biāo)記的肽均勻分布于PNMs表面，UV交聯(lián)時間可調(diào)控肽釋放速率，如BMP-2肽在交聯(lián)20 min時10天釋放量<10%，且不同肽釋放模式不同。

圖5. BMP-2、QK和AF-1肽共軛PNMs的表征。  

6. 人骨髓基質(zhì)細(xì)胞（hBMSCs）在PNMs上的成骨分化，通過CCK-8、免疫熒光染色和qRT-PCR，研究了BMP-2共軛PNMs對hBMSCs增殖及成骨標(biāo)志物表達(dá)的影響，結(jié)果表明BMP-2共軛組hBMSCs增殖更快，RUNX2、OCN等成骨基因表達(dá)顯著上調(diào)，14天后骨鈣素表達(dá)量顯著高于對照組。

圖6. hBMSCs在PNMs上的成骨分化。  

7. 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）在PNMs上的血管生成分化，利用CLSM、細(xì)胞長軸測量和基因表達(dá)分析，研究了QK共軛PNMs對HUVECs形態(tài)及血管生成相關(guān)基因的影響，結(jié)果顯示QK共軛組HUVECs在14天形成微血管網(wǎng)絡(luò)，VEGF、VEGF-R1等基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞長軸長度顯著增加。

圖7. HUVECs在PNMs上的血管生成分化。  

8. AF-1共軛PNMs對巨噬細(xì)胞的抗炎作用，通過Griess法、ELISA和mRNA分析，研究了AF-1共軛PNMs對脂多糖（LPS）刺激的巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響，結(jié)果表明AF-1共軛組顯著降低NO、TNF-α等促炎因子水平，IL-10和ARG1等抗炎基因表達(dá)下調(diào)，表明其抑制巨噬細(xì)胞活化。

圖8. AF-1共軛PNMs對巨噬細(xì)胞的抗炎作用。  

9. 開發(fā)的微球在大鼠體內(nèi)的皮下植入，通過蘇木精-伊紅（H&E）和Masson三色染色，研究了實心、空心和多孔PNMs在植入7天和14天后的組織反應(yīng)，結(jié)果顯示PNMs在14天實現(xiàn)完全組織整合，細(xì)胞浸潤和膠原沉積顯著優(yōu)于實心和空心微球，且促進(jìn)血管生成。

圖9. 微球在大鼠體內(nèi)的皮下植入。

研究結(jié)論
本研究展示了一種通用且可擴(kuò)展的基于3D打印微流控的方法，用于制備尺寸、孔隙結(jié)構(gòu)和形貌精確可控的多孔納米纖維微球（PNMs）。PNMs可通過表面共軛技術(shù)輕松與生物分子功能化，在體外表現(xiàn)出增強(qiáng)的成骨、血管生成和抗炎特性。與實心納米微球相比，PNMs在大鼠皮下植入后促進(jìn)了細(xì)胞浸潤和組織整合。此外，體內(nèi)觀察到的最小纖維化和無縫組織整合突顯了其生物相容性，以及在傷口愈合和組織再生應(yīng)用中進(jìn)一步探索的潛力。這些發(fā)現(xiàn)確立了PNMs作為一種微創(chuàng)治療平臺，可應(yīng)對組織修復(fù)和傷口愈合中的挑戰(zhàn)，并為其在各種再生療法中的應(yīng)用鋪平了道路。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/smll.202502033