體素化生物3D打印構建模塊化雙網絡生物墨水微滴

來源：EFL生物3D打印與生物制造

當前生物制造領域在構建三維組織時面臨關鍵挑戰(zhàn)：傳統(tǒng)生物打印技術難以精準操控高粘彈性生物墨水體素在三維空間中的組裝，且單一網絡水凝膠存在力學性能可調性有限、細胞相容性不足等問題。例如，基于海藻酸鹽的單網絡水凝膠脆性高、力學強度不足，而傳統(tǒng)雙網絡水凝膠常依賴細胞毒性交聯劑（如丙烯酰胺自由基聚合），限制了其在生物醫(yī)學中的應用。   

來自美國弗吉尼亞大學的Li-Heng Cai教授團隊開發(fā)了**體素化生物打印技術（DASP 2.0）**，通過設計無添加劑的生物友好型點擊化學反應（降冰片烯-四嗪配對），實現了聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）或透明質酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網絡生物墨水微滴的數字組裝。該技術利用多通道打印噴嘴實現高粘彈性墨水的按需混合，避免細胞損傷，并通過調控雙網絡的交聯動力學和力學性能（如剛度、延展性），成功構建了復雜三維結構（如空心球體、陀螺狀多孔支架）。體外實驗證實其細胞相容性，體內移植實驗顯示支架在小鼠腹腔內可維持120天結構完整性。   

相關工作以“Voxelated bioprinting of modular doublenetwork bio-ink droplets”為題發(fā)表在《Nature Communications》上。

1. 數字組裝球形顆粒（DASP）構建模塊化雙網絡生物墨水微滴，通過開發(fā)基于聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）和透明質酸/海藻酸鹽（HA/Alg）的雙網絡水凝膠，結合無添加劑點擊化學反應（降冰片烯-四嗪交聯）和多通道打印噴嘴，研究了高粘彈性生物墨水體素的三維精準組裝及力學性能調控。結果表明，DASP 2.0技術可制備互連且可區(qū)分的水凝膠顆粒構建的復雜結構（如空心球體），雙網絡水凝膠的剛度和延展性可通過聚合物濃度和交聯比例調控，且細胞封裝存活率達60%以上。      

圖1. 數字組裝球形顆粒（DASP）的雙網絡生物墨水微滴構建流程。   

2. 單網絡聚酰胺（PAM）水凝膠的交聯動力學與剛度表征，通過流變學測試和理論模型分析，研究了不同NB/TZ比例和聚合物濃度對PAM水凝膠交聯時間和剪切模量的影響。結果表明，凝膠時間隨NB/TZ比例增加呈指數下降，剪切模量與聚合物濃度呈冪律關系（G∝c^2.1），理論模型（G≈kBT/ξ³）可較好描述實驗數據，揭示了點擊化學反應的動力學規(guī)律和網絡形成機制。      

圖2. 單網絡PAM水凝膠的交聯動力學與剛度表征。   

3. 雙網絡（DN）聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）水凝膠的力學性能，通過動態(tài)剪切和單軸拉伸測試，研究了雙網絡結構對水凝膠剛度和延展性的協同效應。結果表明，DN水凝膠的剪切模量約為單網絡組分之和（如PAM₁₀Alg₂的G=11 kPa），拉伸斷裂應變（εf=1.0）較單網絡PAM（εf=0.36）提升近3倍，歸因于弱網絡（海藻酸鹽）先斷裂分散應力的機制。      

圖3. 雙網絡PAM/Alg水凝膠的剛度與延展性分析。   

4. 雙網絡水凝膠的體素化生物打印與機械性能測試，通過開發(fā)雙入口打印噴嘴和靜態(tài)混合腔，研究了DASP 2.0打印復雜三維結構（如空心球體、陀螺狀支架）的能力及循環(huán)壓縮下的力學穩(wěn)定性。結果表明，打印的空心球體由42個互連顆粒組成，陀螺狀支架可承受60%壓縮應變并完全恢復，能量耗散效率僅27.5%，顯示出高彈性和結構完整性。   

圖4. 雙網絡水凝膠的3D打印結構及其循環(huán)壓縮性能。   

5. 體素化打印雙網絡支架的細胞相容性與體內穩(wěn)定性，通過三通道噴嘴封裝Beta-TC-6細胞并移植到小鼠腹腔，研究了支架的體外細胞存活、胰島素分泌功能及體內長期穩(wěn)定性。結果表明，打印后細胞存活率為61.3%±8.0%，3天后仍維持60%以上活性，且支架在體內120天未降解，結構完整，證實其生物相容性和機械魯棒性。      

圖5. 雙網絡支架的細胞封裝、功能驗證與體內移植結果。   

6. 透明質酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網絡生物墨水的普適性研究，通過替換聚酰胺為透明質酸（HA）聚合物，研究了不同生物基雙網絡墨水的打印適應性和細胞相容性。結果表明，HA/Alg雙網絡水凝膠的剪切模量（3050 Pa）和拉伸應變（εf=1.02）與PAM/Alg相當，細胞存活率提升至80%以上，且體內移植30天結構保持完整，驗證了該技術平臺的通用性。      

圖6. HA/Alg雙網絡水凝膠的力學性能、打印性與生物相容性。

研究結論
本研究開發(fā)的體素化生物打印技術（DASP 2.0）通過生物友好型點擊化學反應和多通道噴嘴設計，實現了雙網絡生物墨水微滴的精準組裝與力學性能調控。研究表明，聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）和透明質酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網絡水凝膠可通過調節(jié)聚合物濃度和交聯比例，獲得范圍廣泛的剛度（400 Pa至22 kPa）和延展性（拉伸斷裂應變達1.0），并成功打印出空心球體、陀螺狀支架等復雜三維結構。體外細胞封裝實驗顯示，支架可維持Beta-TC-6細胞60%以上存活率并保留胰島素分泌功能；體內移植實驗證實，支架在小鼠腹腔內120天仍保持結構完整，力學性能穩(wěn)定。此外，透明質酸基雙網絡墨水的細胞相容性提升至80%，拓展了該技術在生物制造中的應用潛力。本研究為構建高復雜度功能性組織工程支架提供了新策略。

文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-49705-z