四川大學(xué)的戎鑫團(tuán)隊(duì)：用于骨再生的 3D 打印多孔納米纖維支架

來源：EFL生物3D打印與生物制造

天然骨組織具有自我更新和修復(fù)的內(nèi)在能力。然而，由于創(chuàng)傷、腫瘤和感染等多種原因?qū)е碌拇笠?guī)模骨缺損的再生仍然是一個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因?yàn)閮?nèi)在的再生機(jī)制通常不足以恢復(fù)組織的完整性。這一持續(xù)存在的臨床難題凸顯了創(chuàng)新方法的必要性。3D打印以其定制復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)的能力而聞名，是組織再生的一個范式轉(zhuǎn)變。它通過忠實(shí)復(fù)制大型復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，比傳統(tǒng)生物支架具有顯著優(yōu)勢。因此，3D打印為減少傳統(tǒng)骨移植的風(fēng)險提供了一條有希望的途徑，包括與組織來源、免疫排斥和疾病傳播相關(guān)的問題。當(dāng)前3D打印技術(shù)在制造具有納米纖維結(jié)構(gòu)的分層3D支架方面存在顯著局限性，這些支架旨在模擬天然骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），以增強(qiáng)骨再生。

來自四川大學(xué)的戎鑫團(tuán)隊(duì)提出了一種創(chuàng)新方法，利用可生物降解的納米纖維微球作為生物墨水，通過3D打印定制具有納米纖維結(jié)構(gòu)的分層多孔支架。體外研究表明，分層多孔結(jié)構(gòu)顯著增強(qiáng)了細(xì)胞浸潤和增殖速率，而納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)提供了物理線索，引導(dǎo)成骨分化和ECM沉積。當(dāng)作為細(xì)胞載體時，3D打印的納米纖維支架促進(jìn)了體內(nèi)骨組織的再生和整合。此外，簡便且多功能的化學(xué)修飾有助于精確定制支架的功能。使用具有高度仿生和多功能修飾特性的納米纖維微球作為這一通用3D打印方法的基礎(chǔ)成分，使得從宏觀外部形態(tài)到分子級生化動力學(xué)的支架生物學(xué)性質(zhì)得到了全面操控，從而滿足多樣化的臨床需求。相關(guān)工作以題為“3D Printing Hierarchical Porous Nanofibrous Scaffold for Bone Regeneration”的文章發(fā)表在2024年11月16日的期刊《Small》。   

【GelMA 納米纖維微球（GMNF-MS）的制備與表征】

GMNF-MS通過結(jié)合微流控技術(shù)和熱誘導(dǎo)相分離（TIPS）技術(shù)合成（圖1A）。在制備過程中，GelMA溶液作為分散相，而礦物油作為連續(xù)相，以生成球形的GelMA滴液，隨后通過TIPS技術(shù)處理形成GMNF-MS。這些GMNF-MS表現(xiàn)出狹窄的尺寸分布。通過調(diào)整連續(xù)相（GelMA溶液）和分散相（礦物油）之間的流速比，可以定制GMNS-MS的尺寸（圖1B–F）。在本研究中，使用了直徑為250 µm的微流控芯片，并且GelMA溶液的流速為0.1 mL h−1。當(dāng)?shù)V物油的流速從4降低到1 mL h−1時，GMNS-MS的直徑分別為55–58 µm和221–223 µm（圖1B–D）。GMNS-MS的直徑符合線性方程Y = −2148.7X + 267.85，其中X是GelMA溶液/礦物油的流速比（圖1F）。

圖1  GelMA納米纖維微球（GMNF-MS）制造示意圖

GMNF-MS的納米結(jié)構(gòu)和孔隙率通過改變GelMA濃度來調(diào)節(jié)。隨著GelMA濃度的增加，觀察到納米纖維結(jié)構(gòu)和多孔特性逐漸減弱（圖2A–E）。當(dāng)GelMA濃度從8%增加到16%時，納米纖維的平均長度從776 ± 175 nm減小到296 ± 71 nm，同時納米纖維的直徑增加。值得注意的是，在20%的GelMA濃度下，納米纖維變粗并聚集（圖2D）。因此，當(dāng)GelMA濃度從8%增加到24%時，GMNF-MS的孔隙率從96%降低到83%（圖2F）。與此同時，GMNF-MS的表觀密度和彈性模量分別增加了三倍和12.5倍（圖2G,H）。此外，GMNF-MS的降解速率隨著GelMA濃度的增加而降低（圖2I）。較高的GelMA濃度導(dǎo)致GMNF-MS的孔隙率和比表面積減少，從而減少了明膠酶的攻擊點(diǎn)并減緩了降解速度。不同濃度的GMNF-MS在30分鐘內(nèi)顯示出相似的平衡溶脹比，約為15倍，表明GelMA濃度對溶脹平衡的影響最�。▓D2J）。鑒于使用12% GelMA制備的GMNS-MS具有優(yōu)化的納米纖維結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)，這些微球被選中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。   

圖2 GMNF-MS的表征

【3D打印分層多孔GelMA納米纖維微球支架（HP-GNMS）和GelMA水凝膠支架（GHS）】   
為打印HP-GNMS，PF-127被用作支撐和犧牲墨水，因?yàn)樗�具有�?yōu)異的流變性能，可以在溫和條件下輕松打印并隨后去除（圖3A）。值得注意的是，30%(w/v)的PF-127在22℃時表現(xiàn)出凝膠狀態(tài)，彈性模量約為0.84 × 104 Pa，而在4℃以下轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)。這種相變簡化了從3D打印的兩相支架中去除犧牲墨水的過程。此外，在4℃下通過高速離心將微球摻入液體PF-127墨水中，結(jié)果形成密集排列的微球以用于3D打印（圖3A）。密集排列的微球顯著改善了生物墨水的流變特性。值得注意的是，在22℃的打印溫度下，含有密集排列微球的生物墨水的彈性模量（2.5 × 104 Pa）明顯高于純PF-127（0.84 × 104 Pa）和在PF-127中均勻分散微球的生物墨水（1.7 × 104 Pa）。此外，在密集排列微球的條件下，由不同濃度GelMA（8%，12%，16%，20%和24%）制成的微球在22℃下的生物墨水彈性模量沒有顯著差異。這表明微球的GelMA濃度對密集排列微球生物墨水的流變特性和可打印性影響不大。

本文發(fā)現(xiàn)：在22℃下形成的Pluronic 127墨水，構(gòu)成了一個次級聚合物網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)出強(qiáng)大的剪切變稀行為，確保在3D打印過程中高效擠出并迅速穩(wěn)定（圖3A）。在整個打印過程中，PF-127的獨(dú)特流變特性在保持密集排列微球的穩(wěn)定性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用（圖3B,C）。此外，PF-127的高粘度使得在氣動擠出過程中堆疊的微球略微變形，從而增加了界面接觸面積，并在光交聯(lián)過程中促進(jìn)了HP-GNMS穩(wěn)定共價鍵的形成（圖3E–H）。交聯(lián)并去除PF-127后，密集排列的微球保持了球形（圖3D）。最終的HP-GNMS沒有明顯的塌陷或突出纖維的扭曲（圖3D,E）。如圖3G,H所示，每個微球與相鄰的微球相互連接，并在HP-GNMS內(nèi)部形成了交織的納米纖維網(wǎng)絡(luò)。機(jī)械分析顯示，凍干的HP-GNMS的彈性模量為1.39 ± 0.19 MPa，超過了大多數(shù)傳統(tǒng)水凝膠支架。雖然均勻分散微球的生物墨水也表現(xiàn)出優(yōu)異的可打印性，但在UV交聯(lián)過程中微球之間缺乏緊密接觸阻礙了共價鍵的形成，導(dǎo)致在去除PF-127后打印結(jié)構(gòu)發(fā)生塌陷。

圖3 分級多孔GelMA納米纖維微球支架（HP-GNMS）和GelMA水凝膠支架（GHS）的制備與表征

【BMSCs在HP-GNMS和GHS上的增殖與滲透】   

BMSCs被接種到HP-GNMS和GHS上，以研究分層納米纖維結(jié)構(gòu)對細(xì)胞滲透和增殖的影響（圖4A）。細(xì)胞生長動力學(xué)揭示了不同的行為。具體來說，GHS上的細(xì)胞在最初5天內(nèi)表現(xiàn)出初始的指數(shù)增長階段，隨后過渡到較慢的穩(wěn)態(tài)階段（圖3M）。相反，HP-GNMS上的細(xì)胞經(jīng)歷了一個延長且更陡的指數(shù)生長期，持續(xù)到第10天，然后進(jìn)入緩慢增長階段。這種差異至少歸因于HP-GNMS的兩個固有特征。首先，相鄰微球之間的間隙形成了一個互聯(lián)的多孔網(wǎng)絡(luò)，為遷移和增殖提供了充足的空間，并增強(qiáng)了氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散。其次，納米纖維結(jié)構(gòu)提供了高表面積，因此提供了足夠的粘附位點(diǎn)供細(xì)胞附著和增殖。因此，BMSCs在HP-GNMS上的生長比在GHS上更為旺盛。

圖4 HP-GNMS和GHS上BMSCs的增殖與浸潤

【HP-GNMS和GHS上BMSCs的成骨分化】

HP-GNMS組在成骨基因（包括SP7、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2) 和骨鈣素（OCN））的表達(dá)水平上顯著高于GHS組。在成骨（圖5E–G）和非成骨分化條件下，均觀察到這種上調(diào)。ALP染色顯示，HP-GNMS組的ALP表達(dá)明顯高于GHS組（圖5A,B）。定量分析進(jìn)一步表明，HP-GNMS在第3天、第7天和第14天的ALP活性分別是GHS的2.2倍、3.5倍和4.2倍（圖5H）。茜素紅染色顯示，HP-GNMS上有均勻的礦物沉積，而GHS組只有少量的礦物沉積（圖5C,D）。鈣沉積的定量評估顯示，HP-GNMS組在第7天、第14天和第21天的鈣沉積量分別是GHS組的9.3倍、16.6倍和19.0倍（圖5I）。Western blot顯示，HP-GNMS組在14天的Col-1表達(dá)量是GHS組的3.4倍（圖5J,K）。免疫熒光染色顯示，HP-GNMS表面（圖6A–C）、間隙內(nèi)（圖6D）以及納米纖維微球內(nèi)部（圖6D,E）有均勻分布的膠原纖維。相比之下，GHS表面上只有少量的Col-1沉積（圖6F–J）。這些結(jié)果表明，與GHS相比，HP-GNMS顯著增強(qiáng)了成骨分化和ECM沉積。

   
圖5 成骨條件下HP-GNMS和GHS上BMSCs的成骨分化

圖6 HP-GNMS和GHS上BMSCs的Col-1分泌與沉積

【體內(nèi)骨再生】
將BMSCs負(fù)載的支架在體外培養(yǎng)3天后植入缺損部位，可以深入了解HP-GNMS在等量外源性干細(xì)胞存在的情況下對骨生成再生的影響。這項(xiàng)研究策略還旨在探討在模擬等量內(nèi)源性干細(xì)胞豐度條件下，具有納米纖維結(jié)構(gòu)的分層多孔支架對骨生成再生的影響。Micro-CT分析顯示，HP-GNMS組的新骨組織顯著覆蓋了缺損區(qū)域，與空對照組和GHS組相比，表現(xiàn)出顯著優(yōu)越的成骨能力（圖7A, B）。HP-GNMS組新骨體積分別是Empty組和GHS組的7.3倍和6.6倍（圖7E）。值得注意的是，在GHS組中，新形成的骨骼主要位于GHS的表面，導(dǎo)致GHS內(nèi)部出現(xiàn)空洞（圖7B，藍(lán)色箭頭）。盡管所有組的新骨密度相當(dāng)（圖7F），但天狼猩紅染色顯示，HP-GNMS組的新骨成熟度更高，表現(xiàn)為亮橙色且更密集排列的膠原纖維（圖7D）。此外，牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP1）的表達(dá)在HP-GNMS組中顯著升高，與Empty組和GHS組相比，DMP1在調(diào)控成骨細(xì)胞分化和成熟、骨細(xì)胞形成以及維持正常骨礦化方面至關(guān)重要，表明HP-GNMS組的骨形成和重塑得到增強(qiáng)。  

圖7 HP-GNMS和GHS作為BMSCs載體在8周后的體內(nèi)骨再生能力評估

【總結(jié)與展望】   
本文開發(fā)了一種結(jié)合微流控和TIPS技術(shù)的工藝，用于制造均勻的GMNF-MS。這些GMNF-MS作為擠出式3D打印墨水的基礎(chǔ)構(gòu)建塊，并用于制備HP-GNMS。在墨水中添加PF 127后，能夠高效地將GMNF-MS通過3D打印制成HP-GNMS。結(jié)果表明，所得的HP-GNMS促進(jìn)了BMSC遷移和增殖。此外，GMNF-MS的納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)提供了有助于引導(dǎo)成骨分化和ECM沉積的物理線索。體內(nèi)研究證實(shí)，HP-GNMS顯著增強(qiáng)了骨組織再生和整合，表明其優(yōu)于傳統(tǒng)的3D打印支架。納米纖維微球的3D打印是開發(fā)生物啟發(fā)材料用于組織再生的新方法。

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202405406