北京協(xié)和毛一雷教授團(tuán)隊(duì)和馬文彬教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表: 3D 生物打印矩陣...

3D3D18(E18)(GelMA)3D neuMatrix3D neuMatrixE18/(MCAO/R)大鼠模型的存活狀態(tài)、功能特征及轉(zhuǎn)錄組特性。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了3D neuMatrix內(nèi)多尺度神經(jīng)回路的形成，展現(xiàn)了其在神經(jīng)發(fā)育研究、疾病建模與藥物篩選及體外智能研究領(lǐng)域的寶貴潛力。
一、背景介紹：
大腦作為高度復(fù)雜的器官，其原代神經(jīng)細(xì)胞模型對神經(jīng)科學(xué)研究至關(guān)重要。傳統(tǒng)2D培養(yǎng)缺乏三維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)刺激，限制了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成。而3D支架、類器官等模型雖部分解決該問題，但仍存在細(xì)胞活力低或結(jié)構(gòu)調(diào)控不足等局限。3D生物打印技術(shù)憑借高通量、設(shè)計自由度高的優(yōu)勢，成為構(gòu)建功能性神經(jīng)組織的新途徑�；�于擠出的生物打印可精準(zhǔn)控制細(xì)胞分布如皮層神經(jīng)元分層、軸突方向性，但原代神經(jīng)細(xì)胞對剪切力敏感，需優(yōu)化打印參數(shù)與生物墨水。本研究選用生物相容性良好的明膠甲基丙烯酰(GelMA)，結(jié)合既往打印功能性肝組織的經(jīng)驗(yàn)，減少細(xì)胞損傷，促進(jìn)突觸連接形成。

最終構(gòu)建的3D neuMatrix是新型3D生物打印原代神經(jīng)組織，具備復(fù)雜的局部與規(guī)模功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。通過單細(xì)胞測序和轉(zhuǎn)錄組分析證實(shí)，其在生理/病理狀態(tài)下均能高保真重現(xiàn)大腦皮層的細(xì)胞亞型與神經(jīng)發(fā)育動態(tài)，為神經(jīng)回路研究、疾病建模、藥物篩選及體外智能領(lǐng)域提供了創(chuàng)新平臺(圖1a)。

圖1. 3D neuMatrix的構(gòu)建流程。

二、材料和方法

2.1 原代皮層神經(jīng)元的3D生物打印

將混合后的生物墨水轉(zhuǎn)移至裝有21G針頭的滅菌注射器中，裝入3D生物打印機(jī)，并預(yù)設(shè)溫度。對噴嘴和成型室溫度進(jìn)行微調(diào)，以確定在打印過程中保持最高細(xì)胞存活率的理想條件。生物打印過程使用基于擠出的生物打印機(jī)(SUNP BIOTECH公司的BioMaker 系列生物3D打印機(jī))，遵循先前建立的方案。簡而言之，3D neuMatrix的整體形狀設(shè)計為立方體，框架間設(shè)有獨(dú)立通道，可最大化原代神經(jīng)細(xì)胞與培養(yǎng)基的接觸面積。通過3D生物打印機(jī)在24孔板的各孔內(nèi)以逐層擠出的方式連續(xù)制備 3D neuMatrix。打印速度設(shè)置為4.8 mm s-1，擠出速度設(shè)置為1.5 mm³ s-1。

隨后，3D neuMatrix經(jīng)7.5 mW/cm-2的405 nm光照射10秒以促進(jìn)交聯(lián)，之后加入1 mL完全培養(yǎng)基，在37°C、5% CO₂條件下培養(yǎng)。整個生物打印過程耗時約1小時。神經(jīng)元成熟通過體外培養(yǎng)7天誘導(dǎo)，每2天更換一半培養(yǎng)基，隨后進(jìn)行后續(xù)評估。

三、結(jié)果

3.1 3D neuMatrix 的關(guān)鍵生物學(xué)特性

將E18大鼠原代皮質(zhì)細(xì)胞與GelMA、光引發(fā)劑按1.5×10⁷ cells/mL密度混合，采用21G 噴嘴(內(nèi)徑510 μm)擠出打印，經(jīng)405 nm光(7.5 mW/cm²)交聯(lián)10秒，構(gòu)建7×7×1.5 mm 含500 μm互連通道的6層結(jié)構(gòu)。優(yōu)化后的參數(shù)減少了剪切力損傷，且可通過自修復(fù)水凝膠浴實(shí)現(xiàn)微型大腦等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的浮動打印(圖1b)。細(xì)胞活力在DIV 7達(dá)峰值(299±20%)，28天培養(yǎng)仍保持活性。HE染色和SEM顯示，細(xì)胞在多孔水凝膠中形成直徑超200 μm的簇，神經(jīng)突相互連接，而2D培養(yǎng)細(xì)胞分布隨機(jī)(圖1c-g)。該模型通過生物墨水與打印工藝優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了原代神經(jīng)細(xì)胞的高活性三維封裝。

3.2 3D neuMatrix 中的多尺度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

體外培養(yǎng)期間，細(xì)胞簇體積顯著增長，前3天擴(kuò)大3倍(8408 μm3增至30215 μm3)(圖2a,b)。Ki67陽性細(xì)胞數(shù)在DIV4達(dá)峰(42.8±5.6個/ROI)，DIV7降至25.5±4.3個/ROI，與體積增長和整體活力趨勢一致(圖2c)。細(xì)胞簇主要由成熟的NeuN陽性神經(jīng)元組成，富含MAP2陽性突起和深染的SYN(表明豐富突觸)。Nestin陽性干細(xì)胞極少。盡管未主動篩選，GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少于神經(jīng)元，并在神經(jīng)簇內(nèi)形成沿神經(jīng)突起延伸的支架樣結(jié)構(gòu)(圖2d,e)。Imaris重建顯示，局部尺度上相鄰簇間存在復(fù)雜多分支神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)(圖2f)。毫米尺度上，整個3D neuMatrix形成了高度類似體內(nèi)大腦樞紐和投射結(jié)構(gòu)的三維神經(jīng)網(wǎng)(圖2g)。

圖2. 3D neuMatrix中獨(dú)特的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3.3 3D neuMatrix 的功能連接與藥物響應(yīng)性

利用Fluo-4 AM可視化鈣振蕩，評估3D neuMatrix的神經(jīng)功能。微觀層面，簇內(nèi)神經(jīng)元獨(dú)立振蕩并間歇性協(xié)調(diào)放電。介觀尺度下，神經(jīng)簇可分為5組，組內(nèi)鈣放電高度同步，相距2 mm的簇組間也存在同步放電，證實(shí)其形成大規(guī)模功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(圖3a-e)。分析 DIV1-14的鈣信號發(fā)現(xiàn)，平均放電率、檢測到鈣放電的簇百分比隨培養(yǎng)時間上升，DIV 14略有下降，與細(xì)胞活力趨勢一致。全局平均相關(guān)性持續(xù)增加。綜合考慮，選擇DIV 7為后續(xù)研究時間點(diǎn)(圖3f - h)。通過神經(jīng)遞質(zhì)受體拮抗劑處理探究小分子影響，抑制GABA受體(BIC、PTX)顯著提升放電率，抑制谷氨酸受體(NBQX、AP5)則降低放電率；除AP5外，其余處理后全局平均相關(guān)性下降。該結(jié)果表明，興奮性與抑制性神經(jīng)元共同參與網(wǎng)絡(luò)形成，二者平衡維持同步性，且3D neuMatrix對小分子的功能響應(yīng)特性，使其適用于CNS疾病建模與藥物篩選(圖3i - l)。

圖3. 3D neuMatrix神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能動態(tài)特性。

3.4 3D neuMatrix 中皮層轉(zhuǎn)錄組譜的重建

為驗(yàn)證3D生物打印神經(jīng)組織的轉(zhuǎn)錄保真度，對2D培養(yǎng)神經(jīng)元、3D neuMatrix和E18大鼠皮層進(jìn)行RNA-seq分析。PCA顯示3D neuMatrix與E18皮層的全局轉(zhuǎn)錄譜相關(guān)性顯著高于2D培養(yǎng)(圖4a,b)。通過差異基因(DEGs)分析，3D neuMatrix中E18皮層特征性上調(diào)/下調(diào)基因的富集分?jǐn)?shù)分別為0.41和-0.39，顯著優(yōu)于2D培養(yǎng)(圖4c-f)。GO和KEGG分析表明，3D neuMatrix激活細(xì)胞互作、ECM組織等通路，而2D培養(yǎng)富集鈣信號及神經(jīng)退行性相關(guān)通路(圖4g-i)。GSVA進(jìn)一步證實(shí)3D neuMatrix與E18皮層的通路富集模式更接近，尤其在神經(jīng)元投射和突觸傳遞等特征上(圖4j)。對關(guān)鍵基因子集的分析顯示，3D neuMatrix在神經(jīng)元突觸、ECM-受體互作等通路更貼近E18皮層，而大腦皮層特有的神經(jīng)發(fā)育調(diào)控通路在體外模型中富集度較低。綜上，3D neuMatrix在分子層面高度重現(xiàn)體內(nèi)神經(jīng)組織特征，具備優(yōu)異的生物學(xué)保真度。

圖4.基于RNA測序驗(yàn)證3D neuMatrix的基因表達(dá)保真度。

3.5 3D neuMatrix 對大腦皮層細(xì)胞組成的重現(xiàn)

為探究3D neuMatrix的細(xì)胞組成及時序動態(tài)，在DIV 1和DIV 7開展snRNA-seq(圖 5a,b)，獲取36304個細(xì)胞并完成類型注釋(圖5a,c,d)。UMAP分析顯示神經(jīng)亞群分布與體內(nèi)皮層神經(jīng)元分層一致，與大鼠皮層數(shù)據(jù)合并后分類穩(wěn)定，細(xì)胞類型比例也與體內(nèi)高度吻合，證實(shí)其精準(zhǔn)重現(xiàn)大腦皮層細(xì)胞組成。

培養(yǎng)期間的細(xì)胞組成符合體內(nèi)發(fā)育趨勢(圖5e)，尤其是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。DIV7時神經(jīng)前體細(xì)胞(NPC)從8.24 %降至1.61 %，星形膠質(zhì)細(xì)胞(ASC)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(ODC)分別增至 13.86 %和3.98 %。興奮性神經(jīng)元(EN)比例從46.64 %降至22.34 %，抑制性神經(jīng)元(IN)穩(wěn)定在22.9%左右，與鈣振蕩同步性增加一致。細(xì)胞周期分析表明DIV7時細(xì)胞分裂能力減弱。(圖5b,e,f)。

偽時間分析顯示，神經(jīng)元呈現(xiàn)從未成熟神經(jīng)元(IMN)到分化神經(jīng)元的發(fā)育軌跡。IMN高表達(dá)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(Fabp7、Vim)，兼具泛神經(jīng)元特征但缺乏成熟標(biāo)志物，可能從分裂狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樾菝郀顟B(tài)；成熟神經(jīng)元的神經(jīng)投射和遞質(zhì)分泌功能隨時間顯著增強(qiáng)，突觸組裝富集度維持較高水平(圖5g-j)。

圖5. DIV 1和DIV 7時3D neuMatrix的單細(xì)胞核RNA測序(snRNA-seq)分析。

3.6利用3D neuMatrix構(gòu)建缺血性中風(fēng)模型

為評估3D neuMatrix在疾病建模與藥物篩選中的潛力，以缺血性中風(fēng)為模型，通過氧-葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)處理發(fā)現(xiàn)，OGD 4小時后細(xì)胞活力降至49.0±0.6%，鈣振蕩的放電速率和放電細(xì)胞百分比顯著降低，全局相關(guān)性呈上升趨勢(圖 6a-e)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，3D neuMatrix的OGD/R模型與大鼠MCAO/R模型的轉(zhuǎn)錄特征更吻合，其上調(diào)的缺氧響應(yīng)、ECM相互作用等通路，較2D培養(yǎng)更準(zhǔn)確模擬了缺血性中風(fēng)的神經(jīng)組織損傷機(jī)制(圖6f-m)。藥物篩選實(shí)驗(yàn)中，依達(dá)拉奉和丁苯酞未能改善OGD/R后的細(xì)胞活力與功能，可能因4小時 OGD已造成不可逆損傷。綜上，3D neuMatrix在神經(jīng)疾病建模和藥物研發(fā)中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢，為體外研究提供了更貼近體內(nèi)環(huán)境的平臺。

圖6. 3D neuMatrix的OGD/R建模與缺血性中風(fēng)特征重現(xiàn)。

四、討論

利用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建了體外神經(jīng)模型3D neuMatrix，該模型僅需7天即可形成具有多尺度功能連接的復(fù)雜可重現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。其鈣信號特征與大腦皮層功能架構(gòu)相似，基因表達(dá)譜比2D培養(yǎng)更貼近E18皮層，且通過單細(xì)胞測序證實(shí)可重現(xiàn)大腦皮層細(xì)胞組成及發(fā)育動態(tài)，為神經(jīng)環(huán)路機(jī)制、CNS疾病機(jī)制、藥物篩選及組織工程研究提供了有價值的體外平臺。

相比傳統(tǒng)2D培養(yǎng)和其他3D建模方法，3D neuMatrix在高通量構(gòu)建、可重復(fù)性及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)空間組織精度上優(yōu)勢顯著。它優(yōu)化了原代皮層細(xì)胞的生物打印流程，避免了iPSC衍生神經(jīng)元成熟度不足的問題，能構(gòu)建多種高保真CNS模型；其展現(xiàn)的多尺度功能性神經(jīng)連接源于3D生物打印的預(yù)設(shè)空間cues，結(jié)合可擴(kuò)展性有望用于神經(jīng)組織修復(fù)與生物計算；在疾病建模方面，可高通量篩選藥物，結(jié)合基因編輯技術(shù)能模擬多種神經(jīng)退行性疾病。

該模型也存在一定局限性，如生物墨水基于明膠無法完全重現(xiàn)大腦ECM，打印過程可能造成剪切力損傷，培養(yǎng)期間細(xì)胞簇增大可能引發(fā)缺氧反應(yīng)，且缺乏血管化結(jié)構(gòu)影響病理模擬完整性。未來需通過優(yōu)化生物墨水、引入新興生物制造技術(shù)及構(gòu)建血管化結(jié)構(gòu)等方式提升模型的生理模擬真實(shí)性。

五、結(jié)論

綜上，利用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建了體外神經(jīng)組織3D neuMatrix，其具有明確的細(xì)胞組成、神經(jīng)環(huán)路及可調(diào)控的空間組織。單細(xì)胞分析顯示，體外培養(yǎng)期間神經(jīng)元亞型和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，神經(jīng)通訊相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。通過3D neuMatrix進(jìn)行的疾病建模證實(shí)，其有望為CNS疾病的發(fā)病機(jī)制和治療研究提供更貼近生理的模型。

六 、參考文獻(xiàn)

H. Yang, J. Zhang, Y. Li, Z. Zhong, W. Li, H. Luo, Y. Liu, L. Ouyang, Z.Jiang, Y. Sun, H. Sun, L. Liu, H. Yang, Y. Wang, N. Yang, W. Ma, Y. Mao,Multiscale Organization of Neural Networks in a 3D Bioprinted Matrix. Adv. Sci.2025, e04455.