預(yù)血管化骨類器官的 3D 生物打印用于快速原位顱骨修復(fù)研究進(jìn)展

來源：EFL生物3D打印與生物制造

顱骨缺損，尤其是關(guān)鍵尺寸的顱骨缺損，因其自身再生能力有限，存在愈合時(shí)間長、再生不完全及骨不連風(fēng)險(xiǎn)高等問題。當(dāng)前臨床修復(fù)手段如金屬植入物、同種異體移植物和人工移植物等，面臨供體有限、存在疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)及修復(fù)效果不理想等挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)骨組織工程的“自上而下”方法（細(xì)胞接種于生物材料支架）存在細(xì)胞分布不均、營養(yǎng)擴(kuò)散不足、支架降解困難等缺陷，且難以復(fù)制骨骼復(fù)雜結(jié)構(gòu)，同時(shí)干細(xì)胞聚集體體外成骨誘導(dǎo)時(shí)間長、血管化不足，限制了快速原位成骨。  

為解決上述問題，清華大學(xué)熊卓、方永聰課題組與北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院楊斌課題組合作，提出一種新型發(fā)育工程策略，將間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）與成骨微顆粒結(jié)合，大規(guī)模構(gòu)建具有自組織血管化和成骨特性的預(yù)血管化骨類器官。團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)篩選出石墨烯氧化物（GO）作為最優(yōu)成骨微顆粒，其通過粘著斑和PI3K/Akt通路顯著促進(jìn)成骨分化。進(jìn)一步將類器官負(fù)載于明膠甲基丙烯酰酯（GelMA）水凝膠中進(jìn)行3D生物打印，構(gòu)建具有高細(xì)胞密度和成骨能力的復(fù)雜組織構(gòu)建體。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該方法可促進(jìn)快速血管化骨組織形成，實(shí)現(xiàn)顱骨缺損的有效原位再生修復(fù)。  

相關(guān)工作以“3D Bioprinting of Prevascularized Bone Organoids for Rapid In Situ Cranial Bone Reconstruction”為題發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》上。北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院2022級整形外科博士生段婧為第一作者，清華大學(xué)熊卓教授、方永聰助理教授及協(xié)和醫(yī)學(xué)院楊斌教授為共同通訊作者。

1. 研究設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)流程示意圖。通過示意圖展示研究整體設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)流程，研究對象為預(yù)血管化骨類器官的構(gòu)建及其在顱骨修復(fù)中的應(yīng)用。結(jié)果表明，結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與成骨微顆粒（如石墨烯氧化物）的預(yù)血管化骨類器官，經(jīng)3D生物打印后可促進(jìn)原位血管化骨再生，為顱骨缺損修復(fù)提供新策略。      

圖1. 預(yù)血管化骨類器官研究設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)流程示意圖。   

2. 預(yù)血管化成骨聚集體的表征與優(yōu)化。采用強(qiáng)制聚集技術(shù)制備含不同成骨微顆粒（羥基磷灰石、生物玻璃、石墨烯氧化物等）的細(xì)胞聚集體，通過實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光染色等方法評估成骨基因表達(dá)與細(xì)胞活性。結(jié)果表明，石墨烯氧化物（GO）組的成骨相關(guān)基因（如ALP、COL-1、Runx-2）表達(dá)顯著高于其他組，且細(xì)胞相容性良好，證實(shí)GO對成骨分化的促進(jìn)作用最優(yōu)。      

圖2. 預(yù)血管化成骨聚集體的表征與優(yōu)化。   

3. 負(fù)載GO的預(yù)血管化骨類器官的成骨與血管化評估。利用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色及血管生成實(shí)驗(yàn)，研究GO負(fù)載的預(yù)血管化骨類器官的成骨礦化能力與血管網(wǎng)絡(luò)形成。結(jié)果表明，GO促進(jìn)鈣沉積與成骨分化，且含內(nèi)皮細(xì)胞的聚集體可自組織形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，CD31表達(dá)證實(shí)血管化能力，說明該類器官兼具成骨與血管化特性。      

圖3. GO負(fù)載預(yù)血管化骨類器官的成骨與血管化特性。   

4. GO促進(jìn)成骨分化的分子機(jī)制轉(zhuǎn)錄組分析。通過mRNA測序與生物信息學(xué)分析，研究GO影響成骨的分子通路。結(jié)果顯示，GO組差異表達(dá)基因富集于粘著斑、PI3K/Akt信號通路等，Western blot驗(yàn)證PI3K、AKT等蛋白表達(dá)上調(diào)，證實(shí)GO通過激活粘著斑和PI3K/Akt通路促進(jìn)成骨分化與細(xì)胞外基質(zhì)合成。      

圖4. 預(yù)血管化骨類器官的轉(zhuǎn)錄組分析與機(jī)制探究。   

5. 預(yù)血管化骨類器官的3D生物打印工藝與性能。選用7.5 wt.% GelMA水凝膠作為生物墨水載體，通過流變學(xué)測試優(yōu)化打印參數(shù)，結(jié)合活/死染色評估細(xì)胞 viability。結(jié)果表明，打印結(jié)構(gòu)具有良好的擠出穩(wěn)定性與細(xì)胞活性（ viability ≈85.63%），且內(nèi)皮細(xì)胞可形成血管網(wǎng)絡(luò)，證實(shí)3D打印技術(shù)可實(shí)現(xiàn)類器官的規(guī)�；瘶�(gòu)建與功能保留。      

圖5. 預(yù)血管化骨類器官負(fù)載生物墨水的3D生物打印。   

6. 顱骨缺損修復(fù)的體內(nèi)效果評估。在大鼠顱骨缺損模型中植入不同處理的生物打印 construct，通過顯微CT、組織學(xué)染色（H&E、Masson三色）及免疫熒光染色評估骨再生與血管化。結(jié)果表明，含GO與內(nèi)皮細(xì)胞的預(yù)血管化骨類器官組（M+H+GO）新骨覆蓋率、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV=32.28±4.48%）及血管密度顯著高于其他組，且促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，證實(shí)其高效的原位骨再生與抗炎能力。      

圖6. 預(yù)血管化骨類器官修復(fù)顱骨缺損的體內(nèi)評估。   

7. 血管化與免疫響應(yīng)評估。利用磁共振成像（MRI）與免疫熒光染色，分析缺損區(qū)域的血管網(wǎng)絡(luò)形成與巨噬細(xì)胞極化。結(jié)果顯示，預(yù)血管化組（M+H、M+H+GO）血管體積顯著大于對照組，且GO負(fù)載組CD163+（M2型）巨噬細(xì)胞比例升高，表明預(yù)血管化骨類器官通過增強(qiáng)血管化與免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)骨再生。      

圖7. 顱骨缺損修復(fù)的血管化與免疫響應(yīng)分析。

研究結(jié)論
本研究提出一種結(jié)合預(yù)血管化骨類器官與3D生物打印的新策略，用于快速原位顱骨再生。通過將間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與成骨微顆粒（如石墨烯氧化物）整合，構(gòu)建了具有自組織血管化能力和增強(qiáng)成骨特性的類器官。3D生物打印技術(shù)將類器官負(fù)載于水凝膠中，形成定制化的大型骨移植物，實(shí)現(xiàn)了接近生理細(xì)胞密度的血管化骨組織構(gòu)建。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，該方法通過激活粘著斑和PI3K/Akt通路促進(jìn)成骨分化，并通過內(nèi)皮細(xì)胞自組裝形成血管網(wǎng)絡(luò)，顯著加速顱骨缺損的原位骨形成，同時(shí)誘導(dǎo)抗炎性M2巨噬細(xì)胞極化。研究結(jié)果表明，這種發(fā)育工程策略克服了傳統(tǒng)支架方法的局限性，為骨再生提供了可擴(kuò)展的有效途徑，有望推動(dòng)生物制造和組織工程在臨床再生治療中的應(yīng)用。


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https://advanced.onlinelibrary.w ... 1002/adhm.202501376