香港理工大學(xué)趙昕、梅全靜等 | 機(jī)械拉伸3D水凝膠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的分化

來源：生物設(shè)計(jì)與制造

本研究論文聚焦3D力學(xué)微環(huán)境誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的定向分化。NSC的定向分化對神經(jīng)再生研究和神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療起著重要作用，在眾多影響神經(jīng)分化的因素中，力學(xué)微環(huán)境是關(guān)鍵的要素之一。既往的神經(jīng)力學(xué)研究多局限于二維環(huán)境(2D)，即使用2D基質(zhì)來闡明機(jī)械刺激對神經(jīng)分化的影響，然而這些2D基質(zhì)難以模擬體內(nèi)NSC三維環(huán)境(3D)。鑒于此，本研究制備了一系列柔軟且有彈性的3D水凝膠來模擬神經(jīng)三維力學(xué)微環(huán)境，并研究了基質(zhì)剛度及機(jī)械拉伸對NSC分化的影響。
研究者以甲基丙烯酸酐化明膠(GelMA)和長鏈聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)為基礎(chǔ)，通過調(diào)整兩者的比例得到了不同模量的仿生水凝膠。研究表明，GelMA-PEGDA水凝膠具有高生物相容性，可支持NSC在3D環(huán)境中生長、增殖、分化。通過觀察NSC在不同基質(zhì)剛度的水凝膠中的狀態(tài)，研究者發(fā)現(xiàn)NSC在相對較硬的基質(zhì)中更傾向于分化成為膠質(zhì)細(xì)胞，而在相對較軟的基質(zhì)中更傾向于分化成為神經(jīng)細(xì)胞。進(jìn)一步的3D拉伸實(shí)驗(yàn)證明，機(jī)械拉伸可以顯著增強(qiáng)NSC的分化和軸突的生長，而且神經(jīng)軸突更傾向于向拉伸方向延伸。免疫細(xì)胞化學(xué)和相關(guān)基因表達(dá)也表明，機(jī)械拉伸可以上調(diào)神經(jīng)分化蛋白和基因的表達(dá)?？傮w而言，本文不僅豐富了NSC在3D力學(xué)微環(huán)境中定向分化的研究，而且為神經(jīng)干細(xì)胞治療的有效性和可行性提供了基礎(chǔ)。

圖1 GelMA-PEGDA水凝膠合成和物理化學(xué)表征

圖中展示了GelMA和PEGDA的合成示意圖及1H-NMR核磁譜圖(a，b)；研究者隨后測試了不同GelMA-PEGDA水凝膠的力學(xué)性能：機(jī)械拉伸(c-e)，循環(huán)拉伸(f-h)及壓縮性能(i-k)

圖2 小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(N2a)在GelMA-PEGDA水凝膠表面(2D)的活力、形態(tài)及增殖

研究者將N2a接種在不同GelMA-PEGDA水凝膠表面，首先通過活/死染色確定N2a細(xì)胞的活力(a)，結(jié)果表明細(xì)胞在水凝膠表面保持90%以上的存活率(c1)；細(xì)胞骨架染色顯示N2a細(xì)胞呈球形，細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間增加(b)；定量細(xì)胞增殖結(jié)果(c2)也表明細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增加，證明GeMA-PEGDA水凝膠具有出色的細(xì)胞相容性

圖3 N2a 細(xì)胞在GelMA-PEGDA水凝膠表面的分化

證明了GelMA-PEGDA水凝膠較高的細(xì)胞相容性之后，研究者進(jìn)一步探討了N2a細(xì)胞在GelMA-PEGDA水凝膠表面的分化。不同時(shí)間的細(xì)胞骨架染色(a)及免疫熒光染色(b)均表明N2a細(xì)胞形態(tài)由圓形變?yōu)樗笮?，且觀察到明顯的突觸生長(c1)和相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)(c2)

圖4 GelMA-PEGDA水凝膠基質(zhì)剛度對3D水凝膠中N2a細(xì)胞分化的影響

確認(rèn)了N2a細(xì)胞在GelMA-PEGDA水凝膠表面的增殖和分化，研究者進(jìn)一步將N2a封裝在3D GelMA-PEGDA水凝膠中?；?死染色表明N2a細(xì)胞在3D水凝膠中生存和增殖良好(a)；顯微鏡觀察(b)、免疫熒光染色(c)和RT-qPCR (d)顯示N2a在較硬的基質(zhì)中更傾向于分化成膠質(zhì)細(xì)胞而在較軟的基質(zhì)中更傾向于分化成神經(jīng)細(xì)胞

圖5 機(jī)械拉伸GelMA水凝膠對3D水凝膠中N2a細(xì)胞分化的影響

隨后研究者研究了機(jī)械拉伸GelMA水凝膠對N2a細(xì)胞分化的影響。首先活/死染色表明拉伸后的細(xì)胞依然保持高的細(xì)胞活性(a)；顯微鏡觀察(b)、免疫熒光染色(c)和RT-qPCR (d)顯示機(jī)械拉伸可以顯著提高神經(jīng)細(xì)胞分化，但由于GelMA水凝膠相對較硬，拉伸后N2a細(xì)胞更傾向于分化為膠質(zhì)細(xì)胞

圖6 機(jī)械拉伸GelMA-PEGDA水凝膠對3D水凝膠中N2a細(xì)胞分化的影響

研究者進(jìn)一步研究了機(jī)械拉伸GelMA-PEGDA水凝膠對N2a細(xì)胞分化的影響。首先活/死染色依然表明拉伸后的細(xì)胞保持高的細(xì)胞活性(a)；顯微鏡觀察(b)、免疫熒光染色(c)和RT-qPCR (d)顯示機(jī)械拉伸可以顯著增強(qiáng)神經(jīng)的分化和軸突的生長，而且神經(jīng)軸突更傾向于向拉伸方向延伸。由于GelMA-PEGDA水凝膠更軟，拉伸后N2a細(xì)胞更傾向于分化為神經(jīng)細(xì)胞