生物3D打印心臟補片通過激活ANGPT1/Tie2通路

供稿人：韓康 賀健康 供稿單位：西安交通大學機械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室


基于生物3D打印技術的新型組織工程策略已成為一種治療動物模型中急性心肌梗死的有效方法。然而，由于移植物存活率低，生物3D打印組織的應用仍然受到限制。因此，通過精確調(diào)節(jié)包裹細胞的3D環(huán)境來提高移植物的存活率是當前研究的重點。目前，韓國高麗大學Do-Sun Lim教授團隊使用人心肌細胞、人心肌成纖維細胞和明膠-甲基丙烯酰-膠原水凝膠等材料以及生物3D打印技術，制備了一種具有多孔網(wǎng)狀結構的新型可移植3D心肌補片（cMesh）。心肌細胞和心肌成纖維細胞在補片中分布良好，且心肌細胞通過間隙連接通道相互連接促進心肌細胞成熟與交流。此外，多孔cMesh補片通過增加與細胞存活相關的mTOR、AKT和ERK信號的磷酸化來顯示其結構優(yōu)勢。在急性心肌梗死大鼠中移植cMesh補片可改善移植物長期存活率、血管形成和穩(wěn)定性、減少纖維化、增加左心室厚度和增強心臟功能。實驗結果證明了多孔cMesh在急性心肌梗死動物模型中提供了結構優(yōu)勢和積極的治療效果。

使用生物3D打印技術制備的cMesh補片相較于手動聚合的cPatch補片具有其獨特的結構優(yōu)勢（圖1A）。 對cPatch和cMesh補片的內(nèi)外部區(qū)域細胞死亡的數(shù)量進行統(tǒng)計顯示（圖1B），cPatch組內(nèi)部死亡細胞率為15%±2.44%，外部死亡細胞率為10%±0.99%。 相比之下，cMesh中的死亡細胞比例在內(nèi)部區(qū)域保持在3.5%±0.82%，在外部區(qū)域為4.1%±1.61%。 基于活/死細胞活力測定的結果，進一步進行了蛋白質(zhì)印跡分析以確認cMesh組和cPatch組中與細胞存活相關的mTOR、ERK和AKT蛋白的表達水平（圖1C）。 結果顯示，與cPatch組相比，cMesh組中的磷酸化mTOR、AKT和ERK信號表達顯著增加，表明多孔cMesh補片能夠顯著促進移植物中細胞的存活。 利用透射電鏡更詳細地觀察了細胞間的相互作用（圖1D）。 在第0天，細胞無法相互交流。 第2天，觀察到細胞鋪展過程，細胞與其他細胞接觸，但沒有連接。 在第4日，觀察到通過細胞間膜連接的細胞。 此外，與細胞膜相互作用的Cx-43和ZO-1蛋白的共表達證實了cMesh中存在結構成熟的人心肌細胞（圖1E）。

圖1 多孔cMesh補片具有獨特的結構優(yōu)勢。(A) cPatch和cMesh制造示意圖，包括多細胞生物墨水。(B) cPatch和cMesh的內(nèi)部和外部區(qū)域示意圖。對外部和內(nèi)部區(qū)域的細胞進行標記，以確定活細胞（綠色）和死細胞（紅色）的分布。(C) 代表性的蛋白質(zhì)印跡分析定量數(shù)據(jù)顯示cMesh與cPatch中mTOR、AKT和ERK的磷酸化情況。(D) 透射電鏡顯示cMesh內(nèi)細胞的超微結構。(E) 細胞間相互作用的標志物ZO-1（綠色）和 Cx-43（紅色）代表性染色圖像。

為了研究多孔cMesh補片修復急性心肌梗死的細胞因子效應，與心臟重塑（MCP-1、ErbB2、MMP-9、MMP-2、TIMP-2、TIMP-1）和血管生成（PDGF-BB、SDF-1、ANGPT-1、ANG、bFGF、EGF）相關的細胞因子陣列在補片植入28天后進行檢測。與第28天的假手術組和cPatch組相比，cMesh組中高度檢測到ANGPT1（圖2A）。同時，量化數(shù)據(jù)顯示，與假手術組和cPatch組相比，cMesh 組的ANGPT1顯著增強（圖2B）。然而，與假手術組相比，cPatch組的ANGPT1水平?jīng)]有顯著差異，因此，在第7天和第28天，使用血清進行ELISA測定來估計cMesh和cPatch組中的ANGPT1的表達。cMesh組中的ANGPT1水平在第7天與cPatch組中的定量相似。相反，與cMesh組相比，cPatch中的ANGPT1水平在第28天顯著降低（圖2C-D）。為了定量比較cMesh和cPatch組中ANGPT-1受體Tie-2表達，通過qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析確認基因表達和蛋白質(zhì)水平（圖2E-G）。cMesh組Tie-2基因表達量高于cPatch組。在第28天，與cPatch組相比，cMesh組的蛋白表達水平也顯著增強。基于先前與血管生成相關的ANGPT/Tie2結果，進行了免疫熒光檢測以評估梗死周圍區(qū)域的血管生成（圖2H）。在移植cMesh和cPatch后的第28天，與假手術組相比，cMesh組和cPatch組的血管生成更顯著。此外，與cPatch相比，cMesh組SMA陽性血管總數(shù)增加（圖2I）。此外，將SMA陽性血管總數(shù)細分為小、中、大血管，cMesh組中大血管的比例高于cPatch和假手術組（圖2J）。

圖2 移植cMesh補片急性心肌梗死大鼠的心臟結構維持和血管形成通過激活ANGPT1/Tie2通路得到改善。(A-B) 假手術組、cPatch組和cMesh組裂解物的代表性心臟重塑和血管生成細胞因子陣列面板與定量分析。(C-D) ELISA測定cPatch和cMesh組中ANGPT1在第7天和第28天的含量。(E) 定量PCR檢測cMesh組與cPatch組大鼠Tie2 mRNA表達水平。(F-G) cMesh組與cPatch組大鼠Tie2蛋白質(zhì)印跡圖像和量化數(shù)據(jù)。(H) 假手術、cPatch cMesh組中成熟血管的免疫熒光圖像。(I-J) SMA陽性血管的定量分析和SMA陽性血管的比例。

這項工作結果表明，生物3D打印制備的多孔心肌補片具有適合的微環(huán)境和機械特性，能夠提高細胞活力并在體內(nèi)長期保留大量細胞，并且有可能提高組織再生的效率。
參考文獻：

    金 KS、Joo HJ、Choi SC 等。 3D生物打印心臟網(wǎng)片移植通過ANGPT1/Tie2通路改善急性心肌梗死大鼠心臟功能和血管形成[J]. 生物制造, 2021, 13(4): 045014. https://doi.org/10.1088/1758-5090/acle78。