近場直寫打印水凝膠復合結構：用于分層誘導功能性軟骨再生

盡管骨軟骨組織工程取得了重大進展，但要成功地重建具有不同空間組成、結構和功能特性的三維類似本源的復雜組織仍是一個挑戰(zhàn)。上海交通大學戴尅戎院士團隊受細胞外基質(ECM)組成的梯度和原生骨軟骨組織中的膠原纖維結構的啟發(fā)，設計并利用近場直寫技術制造了三層：淺表軟骨（S），深軟骨(D)，和軟骨下骨(B)的PCEC分層支架，并在其中填充含有間充質干細胞(MSC)的甲基丙烯酰胺(GelMA)水凝膠與區(qū)域特異性生長因子。復合支架在體內同時實現(xiàn)軟骨和軟骨下骨再生，證明仿生構建模擬自然骨軟骨組織的空間變化，并以增強骨軟骨組織再生的可行性，相關研究成果“Bioinspired stratified electrowritten fiber-reinforced hydrogel constructs with layer-specific induction capacity for functional osteochondral regeneration”發(fā)表于Biomaterials上。

S\D\B的支架使用熔融近場直寫技術制造，其中B層不施加電壓，用不同的打印參數(shù)實現(xiàn)纖維的排列與直徑分布區(qū)別。載細胞的GelMA水凝膠使用紫外線輔助、逐步滲透并交聯(lián)，如Figure 1。層特異性纖維排列和生長因子傳遞的聯(lián)合作用使層特異性誘導BMSCs表現(xiàn)出與原生骨軟骨組織相似的分區(qū)細胞表型和ECM組成。此外，S層的加入可以使再生軟骨具有更潤滑和更耐磨的表面，這對功能性骨軟骨再生至關重要。

圖1 異質復合結構示意圖

異質復合支架的實際打印結果如Figure 2。在PCEC-nHA 支架表面可以觀察到少量分散的HA顆粒，這表明HA納米顆粒已經成功地融入到PCEC支架中。此外，載生長因子的微球和水凝膠中BMP-7、TGF- mik1和BMP-2的累積釋放譜顯示，GFs可以在3周的孵育時間內持續(xù)釋放。

圖2 支架打印結果，支架力學與細胞生長狀態(tài)

不同的支架結構在體外構建S、D和B層，誘導軟骨形成和成骨相關的分區(qū)標記的差異表達，結果如Figure 3。 由于高模量PCEC纖維的增強，本來弱的GelMA水凝膠得到了增強，其壓縮模量與天然軟骨相當。結果表明mRNA和蛋白表達水平等級具有明顯不同，S + G + F組合后的樣品誘導帶顯性標記表達的能力顯著增強。

圖3 不同的支架配方在體外構建S、D和B層，誘導軟骨形成和成骨相關的分區(qū)標記的差異表達

Figure 4顯示了三層S +G + F結構的分區(qū)特異性軟骨形成和成骨相關標記蛋白積累和細胞F-肌動蛋白定向。結果表明，開發(fā)的三層S + G + F結構可能有希望用于工程空間分層的骨-軟骨組織，具有原生細胞定向和帶狀標記蛋白沉積。

圖4 使用S + G + F構建的三層結構使細胞的空間分層定向和區(qū)域標記蛋白在體外積累

研究人員將先前實驗中表現(xiàn)最好的S + G + F組合支架用于兔骨-軟骨缺損模型的修復，如Figure 5。使用單層B、雙層B + D和三層B + D + S復合支架進行術后24周缺陷修復的大體觀察。結果表明，在缺陷區(qū)域引入S層能夠提供潤滑，減輕關節(jié)磨損，并使再生軟骨具有光滑的表面。所有被測組在術后6個月的缺損區(qū)域顯示出相當數(shù)量的鈣化組織。此外，隨著愈合時間的延長，可以觀察到骨沉積增強和支架逐漸降解的情況。

圖5 體外造軟骨成骨效果最好的復合結構組合(S + G + F組合支架)在兔骨-軟骨缺損模型中的研究結果

綜上，在纖維引導和GF誘導的共同作用下，復合結構表現(xiàn)出良好的誘導間充質干細胞向軟骨分化和成骨系分化的能力，并表現(xiàn)出具有空間變化的細胞表型和ECM組成的帶狀組織三維結構。體內軟骨缺損修復實驗進一步證實，纖維增強和生長因子加載的三層水凝膠結構可以同時促進軟骨和軟骨下骨的再生。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120385