FAMU-FSU工程學院化學與生物醫(yī)學工程系教授團隊，采用擠出式生物打印技術(shù)，發(fā)表人工細

3D 3D2DFAMU-FSUSubramanian RamakrishnanJamel Ali”，發(fā)表在 。結(jié)果表明，水凝膠表現(xiàn)出剪切稀化行為，并且細菌濃度增加到對水凝膠前驅(qū)體模量和低剪切粘度沒有顯著影響。然而，將細菌濃度提高到顯著降低水凝膠剪切粘度和模量。利用基于擠出的生物打印，最佳打印參數(shù)在天的孵育期內(nèi)對細菌活力的影響最小。此外，隨著時間的推移，較低濃度的細菌比細胞濃度較高的水凝膠形成更大的聚集體?？傊?，生物膜生長取決于初始細菌密度和基質(zhì)剛性影響。進一步開發(fā)物理化學調(diào)整的生物打印細菌群落將有助于了解其環(huán)境中的細菌相互作用，并為構(gòu)建包含生物膜的體外組織模型用于高通量藥物篩選提供技術(shù)支撐。

一、背景介紹

傳統(tǒng)生物膜研究多在瓊脂等平面基底上進行，揭示了基底剛度等因素對形態(tài)的影響。然而，這些模型無法模擬慢性感染中常見的、嵌入3D環(huán)境(如軟組織)的生物膜特性及其增強的耐藥性。早期將細菌封裝在3D水凝膠(如海藻酸鹽)中的研究顯示出更高的生理相關(guān)性，但仍受限于營養(yǎng)/氧氣梯度問題。

二、材料和方法

3.2 封裝細菌濃度的影響

將不同濃度(1×105至1×1010CFU/mL)的鼠傷寒沙門氏菌封裝入兩種藻酸鹽-明膠水凝膠前體(5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel)中，并在25°C下評估細菌負載量對其粘彈性的影響。結(jié)果表明(圖3)，細菌濃度≤1×107CFU/mL時，對兩種水凝膠的模量(G'和G'')均無顯著影響。然而，濃度達到1×1010CFU/mL時，兩種水凝膠的模量均顯著下降。該極高濃度下的細菌濃縮物本身(S. Paste)表現(xiàn)出類似彈性固體的行為，其模量遠高于純水凝膠，表明其顯著改變了水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。細菌濃度較低時，水凝膠的剪切稀化行為保持不變。但在高濃度(1×1010CFU/mL)下，剪切稀化效應增強。純細菌濃縮物的流變行為則與純水凝膠相似，均表現(xiàn)出剪切稀化特性。

圖3. 包埋不同濃度鼠傷寒沙門氏菌的水凝膠前驅(qū)體流變特性。

3.4 細菌濃度對存活率與生物膜形成的影響

封裝于兩種水凝膠(5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel)中的鼠傷寒沙門氏菌在4天培養(yǎng)期內(nèi)均表現(xiàn)出高存活率(>80%)，且兩者間無顯著差異(圖5c,d)。菌落大小受初始細菌濃度和水凝膠剛度共同影響，低初始濃度(1×105CFU/mL)形成的微菌落顯著大于高濃度(1×107CFU/mL)，例如在5%LA-5%Gel中，低濃度菌落第4天平均面積(30,339 μm2)比高濃度菌落大了約4個數(shù)量級(圖6c)。同時，較硬的5%LA-5%Gel(模量~4.7kPa)中的平均菌落面積也大于較軟的1.5%MA-5%Gel(模量~2.7kPa)，但低濃度導致更大菌落的趨勢在兩種凝膠中均一致(圖6c)。菌落形態(tài)(圓度)主要受初始濃度影響，高濃度(1×107CFU/mL)的聚集體在前3天表現(xiàn)出更高的圓度值(更接近圓形)(圖6f,g)。菌落發(fā)展過程表現(xiàn)為，培養(yǎng)初期(第0天)為分散單細胞(圖7)，4天后發(fā)育成大型密集菌落。值得注意的是，微菌落更大的5%LA-5%Gel水凝膠降解更快，導致其打印結(jié)構(gòu)在4天內(nèi)解體，而1.5%MA-5%Gel結(jié)構(gòu)保持較好。

圖5. 隨時間變化水凝膠打印結(jié)構(gòu)中細菌的存活情況。

圖6. 5%LA-5%Gel和1.5%MA-5%Gel水凝膠打印結(jié)構(gòu)中細菌聚集體的形態(tài)變化與發(fā)育過程。

四、實驗討論

本研究明確了細菌濃度對藻酸鹽基水凝膠的關(guān)鍵影響。初始濃度≤1×107CFU/mL時，水凝膠流變特性和可打印性(基于擠出)幾乎不受影響。然而濃度>1×107CFU/mL會顯著增強剪切稀化行為并降低打印分辨率，強調(diào)了精確控制細菌負載量對維持生物打印所需流變性能的重要性。在3D受限環(huán)境中，生物膜聚集體的生長受初始細菌濃度和水凝膠硬度協(xié)同調(diào)控，在更硬且具有特定應力松弛特性的水凝膠中，較低的初始接種濃度會形成更大的生物膜聚集體。這些發(fā)現(xiàn)為設計調(diào)控水凝膠-細菌相互作用的生物材料(用于組織工程、傷口愈合等生物醫(yī)學應用)提供了重要見解，并為開發(fā)基于力學調(diào)控水凝膠的先進生物膜系統(tǒng)奠定了基礎。

六、參考文獻

Scutte A, Harrison K, Gregory T, Quashie D Jr, Ramakrishnan S, Ali J. Rheological Characterization and 3D Fabrication of Artificial Bacterial Biofilms. ACS Biomater Sci Eng. 2025 Jun 9;11(6):3455-3466. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsbiomaterials.5c00223