生物3D打印定制化胰島特異性微環(huán)境促進(jìn)干細(xì)胞源性胰島成熟的研究

來源：EFL生物3D打印與生物制造

當(dāng)前干細(xì)胞（SC）源性胰島在體外培養(yǎng)時面臨關(guān)鍵挑戰(zhàn)：缺乏天然三維細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）微環(huán)境及血管網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致其成熟度不足，葡萄糖響應(yīng)能力和胰島素分泌功能顯著弱于天然胰島。傳統(tǒng)方法中，單純使用膠原蛋白（Col）或脫細(xì)胞胰腺基質(zhì)（pdECM）無法完全模擬天然胰腺的生化復(fù)雜性，且二維培養(yǎng)或簡單三維聚合難以重現(xiàn)胰島與血管的空間互作關(guān)系。   

來自韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)（POSTECH）的Jinah Jang教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于生物打印技術(shù)的定制化胰島特異性微環(huán)境構(gòu)建方法。該團(tuán)隊(duì)通過優(yōu)化pdECM與基底膜（BM）蛋白（層粘連蛋白和IV型膠原）的組合，制備了仿生“胰島周微環(huán)境樣”（PINE）生物墨水，并利用浴內(nèi)生物打印技術(shù)精確控制胰島樣細(xì)胞聚集體（HICA）與血管結(jié)構(gòu)（V）的空間排布，構(gòu)建了包含ECM、胰島細(xì)胞和血管網(wǎng)絡(luò)的三維整合模型（HICA-V）。該方法通過生化信號（ECM蛋白）與生物物理信號（幾何結(jié)構(gòu)）的協(xié)同作用，顯著促進(jìn)了SC源性胰島的成熟，使其在葡萄糖刺激下的胰島素分泌能力接近天然胰島水平，并能模擬糖尿病病理?xiàng)l件下的藥物響應(yīng)。   

相關(guān)工作以“Bioprinting of bespoke islet-specific niches to promote maturation of stem cell-derived islets”為題發(fā)表在《Nature Communications》上。

研究內(nèi)容
1. 胰腺脫細(xì)胞基質(zhì)與膠原蛋白的蛋白質(zhì)組特征分析，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析（LC-MS/MS）和基因本體論（GO）功能富集，對比脫細(xì)胞胰腺基質(zhì)（pdECM）與膠原蛋白（Col）的ECM成分差異。結(jié)果表明，pdECM含有59種特有ECM蛋白，富含胰腺特異性膠原蛋白（如VI型膠原）、糖蛋白和蛋白聚糖，而Col主要成分為I型和III型膠原；GO分析顯示pdECM蛋白顯著富集于代謝過程和應(yīng)激響應(yīng)通路，更貼近天然胰腺微環(huán)境。      

圖1. 膠原與脫細(xì)胞胰腺基質(zhì)的蛋白質(zhì)組成及功能富集分析。   

2. 定制化胰島微環(huán)境生物墨水的優(yōu)化篩選，通過免疫熒光染色、qPCR和葡萄糖刺激胰島素分泌（GSIS）實(shí)驗(yàn)，評估不同基底膜（BM）蛋白濃度（0.02-0.4 mg/mL）對干細(xì)胞源性胰島細(xì)胞成熟的影響。結(jié)果表明，0.2 mg/mL層粘連蛋白與IV型膠原的組合（PINE生物墨水）可顯著提升胰島素（INS）和嗜鉻粒蛋白A（CHGA）表達(dá)，增強(qiáng)鈣離子（Ca²⁺）對高糖刺激的響應(yīng)，胰島素分泌量較單純pdECM組提升2.3倍。      

圖2. 生物墨水成分對胰島細(xì)胞成熟標(biāo)志物及功能的影響。   

3. 生物打印胰島-血管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)與流變學(xué)特性，利用流變儀測試生物墨水的剪切變稀和自修復(fù)性能，并通過浴內(nèi)生物打印技術(shù)構(gòu)建人胰島樣聚集體-血管網(wǎng)絡(luò)（HICA-V）。結(jié)果表明，PINE生物墨水具有適宜的流變特性（剪切模量G'=10-15 kPa），可精準(zhǔn)打印直徑250-460 µm的HICA和220-356 µm的血管結(jié)構(gòu)，細(xì)胞存活率超94%，且隨時間推移形成緊密的細(xì)胞-ECM網(wǎng)絡(luò)和血管芽生。      

圖3. 生物打印過程的流變學(xué)評估與HICA-V結(jié)構(gòu)表征。   

4. 三維結(jié)構(gòu)對胰島-血管互作功能的影響，通過免疫染色、qPCR和GSIS實(shí)驗(yàn)，對比隨機(jī)分散組、懸浮培養(yǎng)組和HICA-V組的細(xì)胞連接蛋白（CX36、VE-CAD）和分泌因子（FGF、INS）表達(dá)。結(jié)果表明，HICA-V組的間隙連接蛋白和血管內(nèi)皮黏附分子表達(dá)顯著上調(diào)，胰島素分泌量在高糖條件下較隨機(jī)組提升3.8倍，且表現(xiàn)出類似天然胰島的葡萄糖響應(yīng)動力學(xué)。      

圖4. 不同培養(yǎng)模式下胰島-血管互作的功能驗(yàn)證。   

5. 糖尿病病理模型構(gòu)建與藥物響應(yīng)模擬，通過高糖培養(yǎng)（30 mM葡萄糖）誘導(dǎo)HICA-V的 hyperglycemic狀態(tài)，并評估二甲雙胍（Met）與恩格列凈（Empa）聯(lián)合用藥的效果。結(jié)果表明，高糖條件下HICA-V的炎癥因子IL-6和血管黏附分子VCAM-1表達(dá)顯著升高，而藥物聯(lián)合治療可逆轉(zhuǎn)上述變化，恢復(fù)胰島素分泌功能，GSIS指數(shù)較未治療組提升2.1倍，驗(yàn)證了模型在糖尿病研究中的應(yīng)用潛力。   

圖5. HICA-V在高糖環(huán)境下的病理響應(yīng)及藥物干預(yù)效果。   

6. 高糖環(huán)境下HICA-V的藥物干預(yù)機(jī)制分析，通過免疫熒光定量和分泌因子檢測，分析不同藥物處理組（Met-/Empa-、Met+/Empa-、Met+/Empa+）的血管內(nèi)皮功能和β細(xì)胞分泌能力。結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組（Met+/Empa+）的CD31陽性血管密度和胰島素表達(dá)量接近正常對照組，IL-6和VCAM-1基因表達(dá)水平降低60%以上，提示藥物通過改善血管炎癥和增強(qiáng)細(xì)胞間通訊恢復(fù)胰島功能。      

圖6. 抗糖尿病藥物對HICA-V病理模型的治療效果及機(jī)制驗(yàn)證。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了一種基于生物打印技術(shù)的定制化胰島特異性微環(huán)境構(gòu)建方法，通過優(yōu)化脫細(xì)胞胰腺基質(zhì)（pdECM）與基底膜蛋白組成的PINE生物墨水，并利用浴內(nèi)打印技術(shù)構(gòu)建包含胰島樣聚集體（HICA）和血管網(wǎng)絡(luò)（V）的三維結(jié)構(gòu)（HICA-V）。結(jié)果表明，該微環(huán)境可顯著促進(jìn)干細(xì)胞源性胰島的成熟，其胰島素分泌量在高糖刺激下較隨機(jī)培養(yǎng)組提升3.8倍，并表現(xiàn)出與天然胰島相似的葡萄糖響應(yīng)能力。此外，HICA-V能模擬糖尿病高糖環(huán)境下的病理變化，如炎癥因子IL-6和血管黏附分子VCAM-1表達(dá)升高，而二甲雙胍與恩格列凈聯(lián)合治療可逆轉(zhuǎn)上述異常，恢復(fù)胰島功能。本研究構(gòu)建的HICA-V模型為胰島發(fā)育機(jī)制研究、糖尿病病理模擬及藥物篩選提供了新平臺，有望推動干細(xì)胞療法在糖尿病治療中的臨床轉(zhuǎn)化。


文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-025-56665-5