膠原蛋白的快速凝膠化！可用于組織工程與生物3D打印

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在再生醫(yī)學(xué)中，工程化功能性細胞組織組件極具前景。Ⅰ型膠原蛋白作為人體組織中的關(guān)鍵支架材料，在體外以生物相容的方式控制其組裝動力學(xué)存在挑戰(zhàn)，限制了它作為細胞生物制造中的主要支架或粘合劑的應(yīng)用。標(biāo)準的Ⅰ型膠原蛋白在中性pH條件下的凝膠化在長度尺度和幾何形狀上的通用性和可調(diào)性有限，其自組裝難以在空間和時間上精確控制，且典型工作濃度的膠原蛋白溶液流動性高，完全凝膠化通常需要數(shù)十分鐘，這給需要快速組裝或準確定位可溶性膠原蛋白的應(yīng)用帶來了障礙。盡管已有一些技術(shù)實現(xiàn)了對膠原蛋白制造的控制，如紡絲、拉伸、模塑和生物打印等，但這些技術(shù)存在一定局限性，如缺乏復(fù)雜性、受模板限制、化學(xué)修飾影響生理相關(guān)性等，目前在可擴展生產(chǎn)具有高可調(diào)性、精度和靈活性的負載細胞的膠原蛋白組織以滿足組織工程的多樣化需求方面存在強烈限制。

來自美國耶魯大學(xué)的Michael Mak教授團隊開發(fā)了一種稱為可調(diào)快速組裝膠原元件（TRACE）的膠原蛋白制造方法，利用大分子擁擠（MMC）實現(xiàn)未修飾膠原蛋白的即時組裝。該方法通過應(yīng)用惰性擁擠劑加速膠原蛋白的液-凝膠轉(zhuǎn)變，能夠高通量創(chuàng)建從微米到宏觀長度尺度的生理性膠原蛋白構(gòu)建體，并通過生成可調(diào)的多尺度結(jié)構(gòu)線索促進細胞自組裝和形態(tài)發(fā)生。同時，該方法在廣泛的濃度范圍內(nèi)提供了一種通用的膠原蛋白生物打印方法，能夠使用pH中性、具有生物活性的膠原蛋白生物墨水直接打印細胞組織，實現(xiàn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和生物功能性。相關(guān)工作以《Instant assembly of collagen for tissue engineering and bioprinting》為題發(fā)表在《Nature Materials》上。本文共同第一作者為中國青年學(xué)者Xiangyu Gong, Zhang Wen和Zixie Liang。

研究內(nèi)容
1. 基于 MMC 的膠原蛋白即時組裝
通過添加 200 mg/mL 的聚乙二醇（PEG8000）作為擁擠劑，中性膠原液滴在 PEG 浴中1 秒內(nèi)快速凝膠化形成邊界清晰的圓盤，剪切模量驟增表明凝膠強度高。掃描電鏡（SEM）顯示，擁擠環(huán)境促使膠原纖維在界面處快速組裝成薄而致密的纖維網(wǎng)絡(luò)（傳統(tǒng)方法纖維更松散）。

圖 1 MMC誘導(dǎo)的即時凝膠化促進了快速、多尺度的膠原蛋白制造。

2. 高通量微升級膠原凝膠與微米級膠原束
微凝膠制備：通過調(diào)節(jié)液滴體積（1-50 μL）可線性控制膠原圓盤面積，覆蓋 2-10 mg/mL 濃度范圍，甚至酸性膠原也能快速凝膠。細胞負載凝膠可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成骨分化。

微米束制備：通過移液混合膠原與 PEG 浴，利用剪切流誘導(dǎo)膠原形成定向排列的微米級纖維束，其厚度和密度可通過膠原濃度調(diào)控（2-9.5 mg/mL），并用于構(gòu)建纖維化肝腫瘤模型。

3. 宏觀膠原構(gòu)建體與生物打印
宏觀條帶制備：利用 PDMS 多通道裝置，在 PEG 浴中快速擠出膠原條帶，細胞分布均勻且存活良好，可用于構(gòu)建肝組織模型。

自由形式生物打�。涸诤� PEG 的瓊脂糖顆粒支持浴中，實現(xiàn)低濃度膠原（2 mg/mL）的高精度打印，如 “Yale” 標(biāo)志、心臟瓣膜等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，避免墨水?dāng)U散并提升結(jié)構(gòu)保真度。

4. 血管工程與腸管組織構(gòu)建
血管生成：厚膠原束（9.5 mg/mL）因高孔隙率促進內(nèi)皮細胞浸潤和血管網(wǎng)絡(luò)形成，在 VEGF 刺激下生成連通的管腔結(jié)構(gòu)，而薄束（2 mg/mL）因過度壓縮效果較差。

腸管分化：人誘導(dǎo)多能干細胞（hPSCs）負載的膠原條帶經(jīng)定向分化，形成具有隱窩樣芽和中央管腔的腸管結(jié)構(gòu)，表達 SOX17、CDX2 等標(biāo)志物，可維持成熟長達 5 周。

圖 2：內(nèi)皮細胞與膠原束自組裝形成血管網(wǎng)絡(luò)及 sprouting 實驗結(jié)果。

圖 3：hPSC 衍生腸管的形態(tài)變化與免疫染色驗證。

5. 超細絲打印與功能性細胞組織打印
超細絲制備：利用 20 μm 噴嘴和高濃度 PEG（800 mg/mL），以 10,000 mm/min 高速打印出 5-10 μm 寬的連續(xù)膠原絲，甚至可達 2.5 μm 分辨率。
功能性組織打�。贺撦d心肌細胞的膠原墨水可打印收縮性心室模型，表現(xiàn)出自發(fā)鈣瞬變和藥物響應(yīng)，雙心室結(jié)構(gòu)實現(xiàn)同步收縮，泵血功能維持 77 天。

圖 4：超細絲打印流程、速度與纖維寬度關(guān)系。

圖 5：心肌細胞打印構(gòu)建體的鈣瞬變檢測與泵血功能驗證。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)的TRACE方法利用大分子擁擠效應(yīng)實現(xiàn)了未修飾膠原蛋白的即時組裝，能在廣泛濃度范圍內(nèi)高通量創(chuàng)建從微米到宏觀尺度的生理性膠原構(gòu)建體。該方法通過調(diào)控多尺度結(jié)構(gòu)線索促進細胞自組裝與形態(tài)發(fā)生，且無需化學(xué)修飾或高濃度酸性條件，生物相容性高�；�于此的生物打印技術(shù)可直接打印含活細胞的膠原生物墨水，構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和生物功能性的組織，如可收縮的心臟腔室、血管化組織及腸管等。研究拓展了未修飾膠原蛋白在多器官系統(tǒng)組織的可控多尺度生物制造范圍，為再生醫(yī)學(xué)中功能性細胞組織的工程化提供了新策略，相關(guān)成果為復(fù)雜組織的構(gòu)建和器官再生研究奠定了基礎(chǔ)。

文章來源：https://doi.org/10.1038/s41563-025-02241-7