體素化生物3D打印構(gòu)建模塊化雙網(wǎng)絡生物墨水微滴

來源：EFL生物3D打印與生物制造

當前生物制造領域在構(gòu)建三維組織時面臨關(guān)鍵挑戰(zhàn)：傳統(tǒng)生物打印技術(shù)難以精準操控高粘彈性生物墨水體素在三維空間中的組裝，且單一網(wǎng)絡水凝膠存在力學性能可調(diào)性有限、細胞相容性不足等問題。例如，基于海藻酸鹽的單網(wǎng)絡水凝膠脆性高、力學強度不足，而傳統(tǒng)雙網(wǎng)絡水凝膠常依賴細胞毒性交聯(lián)劑（如丙烯酰胺自由基聚合），限制了其在生物醫(yī)學中的應用。   

來自美國弗吉尼亞大學的Li-Heng Cai教授團隊開發(fā)了**體素化生物打印技術(shù)（DASP 2.0）**，通過設計無添加劑的生物友好型點擊化學反應（降冰片烯-四嗪配對），實現(xiàn)了聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）或透明質(zhì)酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網(wǎng)絡生物墨水微滴的數(shù)字組裝。該技術(shù)利用多通道打印噴嘴實現(xiàn)高粘彈性墨水的按需混合，避免細胞損傷，并通過調(diào)控雙網(wǎng)絡的交聯(lián)動力學和力學性能（如剛度、延展性），成功構(gòu)建了復雜三維結(jié)構(gòu)（如空心球體、陀螺狀多孔支架）。體外實驗證實其細胞相容性，體內(nèi)移植實驗顯示支架在小鼠腹腔內(nèi)可維持120天結(jié)構(gòu)完整性。   

相關(guān)工作以“Voxelated bioprinting of modular doublenetwork bio-ink droplets”為題發(fā)表在《Nature Communications》上。

1. 數(shù)字組裝球形顆粒（DASP）構(gòu)建模塊化雙網(wǎng)絡生物墨水微滴，通過開發(fā)基于聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）和透明質(zhì)酸/海藻酸鹽（HA/Alg）的雙網(wǎng)絡水凝膠，結(jié)合無添加劑點擊化學反應（降冰片烯-四嗪交聯(lián)）和多通道打印噴嘴，研究了高粘彈性生物墨水體素的三維精準組裝及力學性能調(diào)控。結(jié)果表明，DASP 2.0技術(shù)可制備互連且可區(qū)分的水凝膠顆粒構(gòu)建的復雜結(jié)構(gòu)（如空心球體），雙網(wǎng)絡水凝膠的剛度和延展性可通過聚合物濃度和交聯(lián)比例調(diào)控，且細胞封裝存活率達60%以上。      

圖1. 數(shù)字組裝球形顆粒（DASP）的雙網(wǎng)絡生物墨水微滴構(gòu)建流程。   

2. 單網(wǎng)絡聚酰胺（PAM）水凝膠的交聯(lián)動力學與剛度表征，通過流變學測試和理論模型分析，研究了不同NB/TZ比例和聚合物濃度對PAM水凝膠交聯(lián)時間和剪切模量的影響。結(jié)果表明，凝膠時間隨NB/TZ比例增加呈指數(shù)下降，剪切模量與聚合物濃度呈冪律關(guān)系（G∝c^2.1），理論模型（G≈kBT/ξ³）可較好描述實驗數(shù)據(jù)，揭示了點擊化學反應的動力學規(guī)律和網(wǎng)絡形成機制。      

圖2. 單網(wǎng)絡PAM水凝膠的交聯(lián)動力學與剛度表征。   

3. 雙網(wǎng)絡（DN）聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）水凝膠的力學性能，通過動態(tài)剪切和單軸拉伸測試，研究了雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)對水凝膠剛度和延展性的協(xié)同效應。結(jié)果表明，DN水凝膠的剪切模量約為單網(wǎng)絡組分之和（如PAM₁₀Alg₂的G=11 kPa），拉伸斷裂應變（εf=1.0）較單網(wǎng)絡PAM（εf=0.36）提升近3倍，歸因于弱網(wǎng)絡（海藻酸鹽）先斷裂分散應力的機制。      

圖3. 雙網(wǎng)絡PAM/Alg水凝膠的剛度與延展性分析。   

4. 雙網(wǎng)絡水凝膠的體素化生物打印與機械性能測試，通過開發(fā)雙入口打印噴嘴和靜態(tài)混合腔，研究了DASP 2.0打印復雜三維結(jié)構(gòu)（如空心球體、陀螺狀支架）的能力及循環(huán)壓縮下的力學穩(wěn)定性。結(jié)果表明，打印的空心球體由42個互連顆粒組成，陀螺狀支架可承受60%壓縮應變并完全恢復，能量耗散效率僅27.5%，顯示出高彈性和結(jié)構(gòu)完整性。   

圖4. 雙網(wǎng)絡水凝膠的3D打印結(jié)構(gòu)及其循環(huán)壓縮性能。   

5. 體素化打印雙網(wǎng)絡支架的細胞相容性與體內(nèi)穩(wěn)定性，通過三通道噴嘴封裝Beta-TC-6細胞并移植到小鼠腹腔，研究了支架的體外細胞存活、胰島素分泌功能及體內(nèi)長期穩(wěn)定性。結(jié)果表明，打印后細胞存活率為61.3%±8.0%，3天后仍維持60%以上活性，且支架在體內(nèi)120天未降解，結(jié)構(gòu)完整，證實其生物相容性和機械魯棒性。      

圖5. 雙網(wǎng)絡支架的細胞封裝、功能驗證與體內(nèi)移植結(jié)果。   

6. 透明質(zhì)酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網(wǎng)絡生物墨水的普適性研究，通過替換聚酰胺為透明質(zhì)酸（HA）聚合物，研究了不同生物基雙網(wǎng)絡墨水的打印適應性和細胞相容性。結(jié)果表明，HA/Alg雙網(wǎng)絡水凝膠的剪切模量（3050 Pa）和拉伸應變（εf=1.02）與PAM/Alg相當，細胞存活率提升至80%以上，且體內(nèi)移植30天結(jié)構(gòu)保持完整，驗證了該技術(shù)平臺的通用性。      

圖6. HA/Alg雙網(wǎng)絡水凝膠的力學性能、打印性與生物相容性。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)的體素化生物打印技術(shù)（DASP 2.0）通過生物友好型點擊化學反應和多通道噴嘴設計，實現(xiàn)了雙網(wǎng)絡生物墨水微滴的精準組裝與力學性能調(diào)控。研究表明，聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）和透明質(zhì)酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網(wǎng)絡水凝膠可通過調(diào)節(jié)聚合物濃度和交聯(lián)比例，獲得范圍廣泛的剛度（400 Pa至22 kPa）和延展性（拉伸斷裂應變達1.0），并成功打印出空心球體、陀螺狀支架等復雜三維結(jié)構(gòu)。體外細胞封裝實驗顯示，支架可維持Beta-TC-6細胞60%以上存活率并保留胰島素分泌功能；體內(nèi)移植實驗證實，支架在小鼠腹腔內(nèi)120天仍保持結(jié)構(gòu)完整，力學性能穩(wěn)定。此外，透明質(zhì)酸基雙網(wǎng)絡墨水的細胞相容性提升至80%，拓展了該技術(shù)在生物制造中的應用潛力。本研究為構(gòu)建高復雜度功能性組織工程支架提供了新策略。

文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-49705-z