《Nature Communications》：“生物3D打?。辈呗杂糜陔y愈合骨缺損的治療

來源： EFL生物3D打印與生物制造

難愈合骨缺損（超過臨界尺寸的節(jié)段骨和骨質疏松骨缺損等）由于內源細胞的遷移受限或再生潛能較弱，無法自行愈合，其修復與功能重建是臨床上一個棘手的問題。由生物材料和健康細胞構成的組織工程骨替代物為解決這一問題帶來了新的希望。盡管過去二十年骨組織工程取得了巨大進展，但仍未解決體外培養(yǎng)耗時且無法精準調控細胞分布等難題。擠出式生物3D打印技術可以實現(xiàn)細胞的精準投遞，為個性化定制材料-細胞復合體提供有效途徑。然而，如何平衡擠出打印過程細胞活性和支架力學穩(wěn)定性方面的難題，既保證3D打印技術的精準度和支架尺寸，同時還能維持負載細胞高存活率，具有較大的挑戰(zhàn)性。

為了解決這一難題，來自中國科學院深圳先進技術研究院阮長順團隊受到心臟搏動泵血的啟發(fā)，提出了一種力學輔助的“生物3D打?。毙虏呗裕紫冉Y合3D打印構建了具有力學響應的大尺寸復雜結構的中空纖維水凝膠支架，然后利用支架力學響應性能實現(xiàn)細胞快速、均勻、精準及友好地加載。基于該策略所獲得的細胞負載支架，有效地促進了難愈合骨缺損的修復與功能重建。該策略有效解決了當前擠出式生物3D打印過程中如何平衡細胞活性和支架力學穩(wěn)定性方面的難題，為組織工程與再生醫(yī)學等領域提供新的思路。

相關研究成果以“A mechanical-assisted post-bioprinting strategy for challenging bone defects repair”為題于2024年4月26日發(fā)表在《Nature Communications》上。

1. 創(chuàng)新型研究內容   

本研究制備了一種可以對力學刺激做出可逆響應的心臟啟發(fā)式結構高度可調的中空纖維水凝膠支架（HHS），可實現(xiàn)快速、均勻、精準及友好地負載。采用甲基丙烯?；髂z、納米粘土和N-丙烯酰甘氨酰胺的混合墨水，通過一步式同軸打印，在無任何內核支撐材料的情況下，實現(xiàn)高保真度和大尺寸HHS的構建，且HHS具有均勻完整且結構高度可調的中空纖維。HHS表現(xiàn)出出色的彈性、快速的形狀恢復和優(yōu)異的疲勞抗性，在壓縮應變達80%下可以快速恢復，并且壓縮循環(huán)1萬次后仍能保持完整的結構。此外，通過壓縮應變、循環(huán)次數(shù)可以實現(xiàn)對其力學響應行為的調控。HHS的力學響應行為使其在力學刺激下實現(xiàn)細胞的快速（4 s）、精準和分區(qū)負載。與靜態(tài)條件下相比，HHS負載細胞數(shù)量提高了13倍。本研究進一步驗證了負載細胞的HHS對大鼠節(jié)段性和骨質疏松骨缺損的修復效果。結果表明，負載細胞的HHS展現(xiàn)出令人滿意的治愈效果?？偟膩碚f，本研究工作為細胞和生物材料的功能組裝提供了一種新的、通用的、高效的途徑，推動組織工程及細胞治療用于再生醫(yī)學。

【大尺寸復雜結構HHS構建】
本研究基于同軸3D打印，在沒有任何內核支撐材料的情況下，一步法直接構建大尺寸復雜形狀的組織工程骨（圖1a, b）。采用具有優(yōu)異打印性、足夠力學強度及生物相容性的甲基丙烯?；髂z/硅酸鋰納米粘土/ N -丙烯酰甘氨酰胺復合材料作為打印墨水，經同軸針頭的外殼擠出后紫外光照射固化，獲得具有高保真度穩(wěn)定形狀的HHS，可以懸浮在水中，中空通道清晰可見（圖1c），表明構建具有中空結構的HHS可行性。

圖1 “生物3D打?。辈呗约敖M織工程骨支架構建示意圖

【中空結構和網格可調的HHS】

HHS的中結構和網格具有高度可調控性。如圖2a所示，研究者定義了HHS中空纖維內徑和外徑（分別為d和D）、同層兩根中空管之間的最近距離（L）、中空纖維的空間體積（V1）以及網格內部的體積（V2）。如圖2b,c和d所示，可以清晰地觀察到光滑均勻的空心管，空心結構完整以及高保真度的網格，其L、D和D具有廣泛的可調性。通過GeSiM Robotics軟件可以輕松調節(jié)Lx，而通過調節(jié)同軸噴嘴的內外尺寸可以調節(jié)中空管的Dy（y范圍為0.4 ~ 0.8 mm）、dz（z范圍為0 ~ 0.6 mm）和壁厚Dy - dz（0 ~ 0.4 mm），從而調控HHS的性能，表明研究團隊打印的HHS具有出色的可設計性。

圖2 HHS可調的中空結構和網格

【HHS的可壓縮性、彈性、形狀恢復性和疲勞抗性】

HHS具有優(yōu)異的壓縮性和回彈性，快速的形狀恢復以及優(yōu)異的抗疲勞性能。研究者進一步通過壓縮和循環(huán)壓縮實驗，全面研究了中空纖維內徑d對HHS力學行為的影響。隨著d的增加，HHs的壓縮強度和彈性提高，即使在80%的應變后仍然保持完整且可以恢復到初始狀態(tài)（圖3a）。此外，研究者通過螢光液體直觀地呈現(xiàn)了HHS的壓縮恢復速度，一個周期的壓縮和形態(tài)恢復僅需要4 s，且1 s內即可快速恢復，與心臟收縮和舒張搏動相似。隨后，在應變?yōu)?0%的情況下，驗證了HHS的可重復性和抗疲勞性（圖3c,d）。無中空結構的支架在102個循環(huán)后發(fā)生了嚴重的損傷，而HHS在104個循環(huán)后保持結構完整。結果表明，HHS具有優(yōu)異的抗疲勞性能。

圖3 HHS的力學性能

【HHS的力學響應性】

HHS具有力學響應行為，能夠快速響應外界力學的刺激。研究者為了進一步研究其力學響應性，將HHS浸泡在有或無力學刺激的水中，如圖4a、b所示，在沒有力學刺激的情況下，其吸水能力取決于網格而不是GLN水凝膠的溶脹或HHS的中空結構（圖4c）。此外，HHS吸水率隨應變和循環(huán)次數(shù)的增加而顯著增加，而不含V1的HHS吸水率則保持恒定（圖4d-f）。此外，L和d也會顯著影響HHS水吸收。此外，在20%和40%的應變下，吸水率隨循環(huán)次數(shù)的增加而顯著增加（圖4f）。由此可見，在動態(tài)力學刺激下，V1使得HHS具有良好的力學響應能力，且隨著d、應變和循環(huán)次數(shù)的增加，其力學響應能力增強。

圖4 HHS的力學響應性

【HHS快速、均勻、精準及友好負載細胞的能力】

本研究基于HHS的快速壓縮恢復能力和優(yōu)異的力學響應性，開發(fā)了一種力學輔助的“生物3D打?。辈呗?，以實現(xiàn)快速、均勻、精確和友好的細胞負載。如圖5a,b所示，與靜態(tài)條件相比，4 s內HHS負載的細胞數(shù)量顯著提高了約13倍，這表明V1 -力學響應途徑的主動性和有效性。培養(yǎng)3 d后，HHS中細胞分布均勻且增殖明顯。同時，HHS中負載細胞的數(shù)量隨著壓縮應變（圖5c）或循環(huán)次數(shù)（圖5d）的增加而增加，表明研究者提出的策略具有可控制性。在傳統(tǒng)的組織工程中，無法將多種類型的細胞分區(qū)引入到支架中。在本研究中，利用V1和V2之間不同的力學響應性，可以實現(xiàn)多個細胞的精確分區(qū)負載。如圖5ei所示，研究者進一步開發(fā)了一種簡單的V2-力學響應途徑，與直接接種細胞相比，細胞均勻分布在整個HHS的V2中（表面-中間-底部）（圖5eii,eiii）且HHS的V2中的數(shù)量提高了約200%（圖5eiv）。如圖5f所示，通過V1+V2-力學響應的連續(xù)過程，實現(xiàn)了兩種細胞分區(qū)負載于在V1和V2中。此外，HHS可維持內皮細胞表型和促進干細胞成骨分化（5g,h）。

圖5 HHS力學響應負載細胞

【負載細胞的HHS修復難愈合骨缺損】

本研究進一步評估了負載細胞的HHS修復大鼠臨界節(jié)段性骨缺損和骨質疏松骨缺損的能力。對于大鼠大尺寸節(jié)段性骨缺損的修復（圖6），負載細胞的HHS相比于空白和HHS組術后6周顯著促進周圍新生血管的形成，術后12周在股骨缺損的近端和遠端形成橋接，且負載細胞的HHS新生骨量可達到HHS組的2.5倍。在大鼠骨質疏松骨缺損修復方面，術后4周和8周負載細胞的HHS組相比于空白和HHS組同樣呈現(xiàn)更為優(yōu)異的骨再生能力（圖7）。研究表明，對于難愈合骨缺損而言，結合細胞的HHS在骨缺損的修復與功能重建方面顯示出令人滿意的治療效果。

圖6 負載細胞的HHS修復大鼠大尺寸節(jié)段骨缺損的研究

圖7 負載細胞的HHS修復骨質疏松大鼠骨缺損的研究

2. 總結與展望
總之，本研究通過一種簡單的一步同軸打印方法，在無內核支撐材料的情況下，成功3D打印制備了一系列中空纖維結構高度可調的大尺寸復雜結構HHS。所得到的HHS表現(xiàn)出優(yōu)異的彈性、快速的形狀恢復和出色的疲勞抗性，并顯示出可控的力學響應行為。利用HHS力學響應性能可實現(xiàn)細胞快速、均勻、精準及友好地加載。所獲得的細胞負載HHS，有效地促進了難愈合骨缺損的修復與功能重建，推進了組織工程在骨再生領域的應用。本研究提出的力學輔助“生物3D打?。毙虏呗?，有效解決了當前擠出式生物3D打印過程中難以平衡細胞活性和支架力學穩(wěn)定性方面的難題，為細胞和生物材料的功能組裝提供了一種新的、通用的、高效的途徑，推動組織工程及細胞治療用于再生醫(yī)學。

文章來源：https://doi.org/10.1038/s41467-024-48023-8