《Biofabrication》：熱噴墨生物打印顯著改變細胞表型

來源： EngineeringForLife

細胞噴墨生物打印，全稱為三維細胞打印技術，是一種利用數(shù)字控制的噴墨技術，將細胞、生物材料和生長因子等組成部分精確地排列在生物基質上，生成三維生物結構的生物醫(yī)學技術。該技術于2003年首次被開發(fā)出來，并逐漸得到廣泛應用。細胞噴墨生物打印的工作原理類似于普通的噴墨打印，但使用的液體不是油墨，而是由細胞、生物材料和生長因子等組成的生物水溶液。這些水溶液錯層地依次加注入噴頭中，并且通過高頻振動或氣體壓縮來噴出微小的液滴。然后，這些液滴可以準確地落在預設的位置上，建立所需的三維生物結構，最終形成具有特定功能的人工組織、器官或外皮層。

相比于傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)技術，細胞噴墨生物打印可以創(chuàng)造出具有更高密度和更真實感的細胞模型，具有更好的仿真性和可重復性。同時，這種技術還可以直接將大量的細胞植入到缺陷組織中進行修復和再生，從而避免了傳統(tǒng)醫(yī)療方案中可能存在的移植物排斥反應和外科手術造成的創(chuàng)傷。截至目前，細胞噴墨生物打印已經(jīng)成功應用于許多領域的研究和實踐中。例如，在組織工程領域，該技術可以用來構建人工骨骼、肌肉、血管等各種不同類型的組織；在外科手術領域，該技術可以用來為患者進行皮膚移植或骨骼修復等手術；在藥物研發(fā)領域，該技術可以用于篩選新藥并評估其治療效果。然而，與其他新興技術一樣，細胞噴墨生物打印也面臨著一些挑戰(zhàn)和限制。量化打印機的輸入和測量打印機的輸出一直是生物打印領域努力的方向，因為幾乎不可能表征打印孔或內部的細胞擠壓針。

來自美國得克薩斯大學埃爾帕索分校的Thomas Boland團隊描述了一些最近因噴墨生物打印而發(fā)現(xiàn)的細胞行為。首先，將原代和永生化成人真皮成纖維細胞在接收后擴增 2-3 代，然后收集細胞，將其重懸于 PBS 中，并使用 pluriSTEM 培養(yǎng)基將其生物打印到 96 孔板中。然后將細胞轉移到預涂的 96 孔板中，或移取 20 μL 液滴進行懸滴培養(yǎng)。應用 IPC 分化方案并在打印后約 45 分鐘開始誘導。當分化聚集體時，起始發(fā)生在聚集體轉移到 96 孔板中，在 45 分鐘后標準免疫染色和 RNA-Seq 分析細胞表型。初步結果表明所有細胞都表達了三種多能性標記 oct-4、nanog 和 sox-2。應用心肌細胞分化方案后，細胞的肌鈣蛋白 3 染色呈陽性。細胞也伸長并且在形態(tài)上變得更像心肌細胞。本研究分析了大量 RNA 序列數(shù)據(jù)，本研究的初步結果顯示一些與干細胞標記有關的基因上調：EPCAM、LEFTY1、ZFP42 和 TEX19。此外，與多能性相關通路相關的基因的差異表達表明，一些通路已關閉，如預期多能狀態(tài)的 MAPK/p38、MAPK/JNK1-3。本研究也有數(shù)據(jù)支持通過 TAZ 高度上調和 YAP 染色細胞體激活河馬途徑。此外，GSK3B 處于關閉狀態(tài)，TGFB1、LIF/PIK3 和 AKT1 處于多能性預期狀態(tài)。檢查上調基因的基因網(wǎng)絡，可以清楚地區(qū)分與多能性相關的 FOS、FOXO1 和 PIK3 的關鍵作用。生物打印的成纖維細胞至少會暫時采用更原始或去分化的狀態(tài)，這讓人聯(lián)想到多能性。雖然免疫化學顯示了多能性所需的經(jīng)典轉錄因子，但基因表達顯示了印刷時發(fā)生的轉化的更微妙的畫面。了解這些轉變，即使是暫時的，在嘗試使用生物打印技術構建組織時也至關重要。相關工作以題為“Thermal inkjet bioprinting drastically alters cell phenotype”的文章發(fā)表在2023年5月9日的國際著名期刊《Biofabrication》。

1. 創(chuàng)新型研究內容

圖 1 展示了打印后 24 小時 TIB 成纖維細胞的抗體染色，標記有針對 OCT-4（綠色）、Sox2（紅色）和 Nanog（紅色）的熒光標記初級單克隆抗體。未打印但接受相同處理的對照細胞也顯示在圖中并且未顯示任何染色。還展示了通過懸滴法形成并用三種抗體染色的細胞聚集體的染色。類似于鋪板細胞的圖像，OCT-4 在所有細胞中表達，但轉錄因子 Nanog 似乎并未在所有細胞中表達，而是集中在聚集體的內部質量上。雖然 Sox-2 存在于所有鋪板細胞中，但它在 2 日齡聚集體中的表達似乎低于新打印細胞中的表達。初步結果表明所有細胞都表達了三種多能性標記 oct-4、nanog 和 sox-2。應用心肌細胞分化方案后，細胞的肌鈣蛋白 3 染色呈陽性。細胞也伸長并且在形態(tài)上變得更像心肌細胞。本研究分析了大量 RNA 序列數(shù)據(jù)，本研究的初步結果顯示一些與干細胞標記有關的基因上調：EPCAM、LEFTY1、ZFP42 和 TEX19。此外，與多能性相關通路相關的基因的差異表達表明，一些通路已關閉，如預期多能狀態(tài)的 MAPK/p38、MAPK/JNK1-3。本研究有數(shù)據(jù)支持通過 TAZ 高度上調和 YAP 染色細胞體激活河馬途徑。此外，GSK3B 處于關閉狀態(tài)，TGFB1、LIF/PIK3 和 AKT1 處于多能性預期狀態(tài)。通過檢查上調基因的基因網(wǎng)絡，可以清楚地區(qū)分與多能性相關的 FOS、FOXO1 和 PIK3 的關鍵作用。

圖1 共聚焦顯微鏡圖像顯示 OCT-4、Sox-2 和 Nanog 蛋白以及 DAPI 的染色

圖 2 展示了打印后立即接受心肌細胞分化方案的 TIB 成纖維細胞，該細胞用標有 Alexa Fluor 647 的初級肌鈣蛋白 I 型 3（心臟）抗體染色。含有鍍層成纖維細胞的對照樣品進行了相同的分化和染色工藝，但未進行生物打印，結果表明其未顯示任何染色。大多數(shù) TIB 細胞顯示出細長的矩形細胞形態(tài)，并且肌鈣蛋白 I 呈陽性，比對照細胞長得多。細胞似乎沿著一個共同的軸伸長，并且在一些圖像中可以看到它們相互作用或相互連接。據(jù)本研究所知，這是第一次報告這種細胞狀態(tài)，本研究稱之為應變誘導的臨時自動啟動重編程或 SITAR。在本研究的觀察中，這種重新編程是暫時的，并且隨著時間的推移，三個標記的表達水平會降低。這可以通過比較 3 至 4 天的聚集體中 Sox-2 或 Nanog 的染色與這些因子在鍍層的新鮮印刷細胞中的染色來理解。然而，經(jīng)過多能干細胞合格培養(yǎng)一周后，仍然可以觀察到一些染色。盡管如此，它仍然只出現(xiàn)在細胞體的下部，或者可能與細胞外基質凝膠結合，細胞被接種在凝膠上。SITAR 狀態(tài)的臨時性質也可以解釋生物打印文獻中缺乏報告的原因，即使生物打印已成為許多實驗室廣泛使用的工具。大多數(shù)團隊會在生物打印后添加特定的介質，這種介質已被開發(fā)用于維持分化的細胞。本研究假設這些介質加速從 SITAR 狀態(tài)重新分化為原始細胞類型。

圖2 打印后立即接受心肌細胞分化方案的 TIB 成纖維細胞

為了開始了解這一發(fā)現(xiàn)的起源，本研究進行了許多基本實驗。圖 3A 展示打印后 3 小時的 TIB 細胞 YAP（紅色）α-微管蛋白（綠色）和細胞核（藍色）染色，而圖 3B 顯示打印后 24 小時的細胞。據(jù)推測，使用熱噴墨打印機時提供給電池的熱量可能會導致 SITAR。通過手動將細胞噴射通過打印頭中的孔來排除這種熱沖擊，沒有提供外部電源并且仍然觀察到正在表達的三種多能標記。然而，當將打印頭浸入培養(yǎng)基中時手動迫使細胞懸浮液通過孔口時，不會觀察到 SITAR。因此進一步排除了細胞通過 80 um 孔時所經(jīng)歷的剪切可以解釋該現(xiàn)象。因此，本研究目前的解釋是，細胞周圍小液滴的形成是導致去分化的觸發(fā)事件。本研究打印設置中的液滴大小約為 80 pl，液滴從孔板中出來時有很長很細的尾巴。在這些液滴中，細胞膜在幾分之一秒內被拉伸和壓縮，這種應變的突然變化被轉化為細胞核，在那里開始表達更原始或原始的基因。然而，在這一點上，本研究沒有這方面的證據(jù)，本研究只是報告 TIB 后 24 小時到幾天后的細胞狀態(tài)。

圖3 打印后 3 小時 (A) 和 24 小時 (B) 后表達 YAP（紅色）和 Alpha 微管蛋白（綠色）的 TIB 成纖維細胞

圖 4 顯示了打印后 2 小時和 12 小時與多能性相關通路相關的基因的差異表達。已顯示下調和上調的基因分別以紅色和綠色顯示。圖 5 則顯示了印后 12 小時 TIB 細胞顯著上調基因的基因網(wǎng)絡。還應注意，TIB 樣本中的所有細胞都表達 OCT-4，大多數(shù)細胞表達 Sox-2，并且 Nanog 染色的細胞略少。雖然更傳統(tǒng)的多能干細胞生成方法是高度手動的，需要手工挑選用于培養(yǎng)的細胞很少，但 TIB 方法是自動化的，不需要人工干預，這對于稱為全自動系統(tǒng)的某些應用程序可能是一個優(yōu)勢，例如用于大批量制造。由于 SITAR 狀態(tài)的短暫性，本研究沒有觀察到干細胞樣特征在細胞分裂后傳遞給子細胞。目前本研究還不知道培養(yǎng)物是否可以繁殖。TIB 細胞可以在打印后立即冷凍保存，方法是將 10% DMSO 添加到打印細胞的小瓶中的介質中，并以每分鐘 1C 的速度緩慢冷卻。在冷凍保存和解凍實驗中，按照標準方案去除冷凍保護劑，細胞對測試的三種標記物仍然呈陽性。

圖4 多能性相關通路相關基因的差異表達

據(jù)本研究目前所知，SITAR 細胞并不是真正的多能細胞。例如，即使表達了指示多能性的標記，在植入 TIB 細胞的十年研究中，本研究也從未在動物身上看到過畸胎瘤的形成。然而，最近植入 SITAR 細胞聚集體的初步實驗可能在植入 4 周后顯示未成熟的畸胎瘤；這些發(fā)現(xiàn)需要在更長的植入時間內重復。這與似乎沒有集落形成和將特征傳遞給子細胞一起，向我們表明 SITAR 細胞的狀態(tài)是短暫和不穩(wěn)定的，但可以通過在生物打印后允許細胞聚集來延長。

圖5 12小時顯著上調的基因網(wǎng)絡圖

2. 總結與展望
本研究發(fā)現(xiàn)成年原代成纖維細胞在 80 pl 液滴內拉伸時至少會暫時采用更原始或去分化的狀態(tài)，這讓人聯(lián)想到多能性。多能性細胞可以分化成心臟譜系等。這種稱之為 SITAR 的現(xiàn)象被認為發(fā)生在所有經(jīng)歷應變的細胞中，進一步探索 SITAR 狀態(tài)可能會導致利用內在潛力和再生醫(yī)學的新了解。

文章來源：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acd3b3