3D 打印透明質(zhì)酸 - 膠原顆粒凝膠負(fù)載 BMP-7 化學(xué)修飾 RNA 促進(jìn)骨再生

來源：EFL生物3D打印與生物制造

隨著人口結(jié)構(gòu)變化和生活方式的改變，骨缺損的發(fā)生率呈上升趨勢，目前臨床治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)仍是自體骨移植，但該方法存在供體部位并發(fā)癥、可獲取骨量有限以及因有創(chuàng)操作導(dǎo)致的感染風(fēng)險等缺點。盡管骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）如BMP-2和BMP-7在骨科應(yīng)用中已獲批準(zhǔn)，但其半衰期短，臨床需使用超生理濃度，可能引發(fā)嚴(yán)重副作用?；贒NA的基因治療雖有應(yīng)用，但化學(xué)修飾RNA（cmRNA）因穩(wěn)定性更高、免疫原性更低等優(yōu)勢嶄露頭角，不過尚無針對cmRNA遞送的特異性激活基質(zhì)用于骨再生的相關(guān)研究。   

來自瑞士AO研究所的Matteo D’Este教授團(tuán)隊，開發(fā)了一種3D打印透明質(zhì)酸-膠原顆粒凝膠（THA-Col微凝膠），用于遞送BMP-7 cmRNA以促進(jìn)骨再生。該團(tuán)隊通過機(jī)械破碎法制備微凝膠，并與未破碎的塊狀凝膠對比，評估其流變學(xué)、溶脹性、降解性、機(jī)械性能及打印適性。實驗表明，微凝膠支持BMP-7 cmRNA轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs），且細(xì)胞存活率高于塊狀凝膠，同時能促進(jìn)hMSCs的成骨分化。相關(guān)工作以“Implementing BMP‐7 Chemically Modified RNA for Bone Regeneration with 3D Printable Hyaluronic Acid-Collagen Granular Gels”為題發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》上。

研究內(nèi)容
1. THA-Col微凝膠的制備與打印性能分析   通過酶交聯(lián)結(jié)合機(jī)械破碎法制備THA-Col微凝膠，利用流變儀測試其粘彈性、剪切變稀特性及彈性恢復(fù)能力，并通過擠出成型評估打印適性（絲材鋪展、融合度、孔隙幾何形狀及懸垂能力）。結(jié)果顯示，微凝膠G''值高于塊狀凝膠，具備剪切變稀行為及良好彈性恢復(fù)，打印絲材鋪展比1.3、均勻度略超1，孔隙接近正方形（Pr<1），可橋接6 mm懸垂間隙，證實其適用于3D打印。   

圖1. THA-Col微凝膠基質(zhì)制備示意圖。   

圖2. 3D打印THA-Col微凝膠的流變與打印性能表征。   

2. 微凝膠與塊狀凝膠的理化性質(zhì)對比   通過溶脹實驗、酶降解測試及壓縮力學(xué)實驗，對比THA-Col微凝膠與塊狀凝膠的溶脹率、降解速率和機(jī)械強(qiáng)度。結(jié)果表明，兩者48小時內(nèi)均無明顯溶脹，微凝膠在透明質(zhì)酸酶溶液中48小時降解率達(dá)50%（塊狀凝膠28%），壓縮模量為27 kPa（塊狀凝膠34 kPa），顯示微凝膠孔隙結(jié)構(gòu)導(dǎo)致更高降解性和更低剛度。   

圖3. THA-Col塊狀與微凝膠的溶脹、降解及壓縮性能分析。   

3. 體外細(xì)胞毒性評估   依據(jù)ISO-10993-5標(biāo)準(zhǔn)，通過L929細(xì)胞的代謝活性、DNA含量、LDH釋放及活/死染色，評估THA-Col基質(zhì)的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，微凝膠與塊狀凝膠的條件培養(yǎng)基均未顯著影響細(xì)胞活性，活細(xì)胞比例與陰性對照無差異，證實兩者生物相容性良好。   

圖4.THA-Col塊狀與微凝膠的體外間接細(xì)胞毒性測試。   

4. BMP-7 cmRNA轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞響應(yīng)   通過MetLuc熒光素酶報告基因和ELISA檢測，分析hMSCs在微凝膠與塊狀凝膠上的轉(zhuǎn)染效率及BMP-7蛋白分泌。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后1天MetLuc活性和BMP-7分泌量最高，微凝膠與塊狀凝膠的轉(zhuǎn)染組與預(yù)轉(zhuǎn)染陽性對照組無顯著差異，但微凝膠組細(xì)胞代謝活性略高，證實微凝膠支持高效轉(zhuǎn)染且細(xì)胞毒性較低。   

圖5. BMP-7 cmRNA在THA-Col基質(zhì)上的轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性分析。   

5. 成骨分化能力與機(jī)制研究   通過ALP活性染色、OPG分泌檢測及成骨基因表達(dá)分析，評估轉(zhuǎn)染BMP-7 cmRNA的hMSCs在微凝膠與塊狀凝膠上的成骨分化能力。結(jié)果顯示，微凝膠組非轉(zhuǎn)染細(xì)胞ALP活性顯著高于塊狀凝膠，轉(zhuǎn)染組OPG/DNA比值升高，RUNX2/SOX9基因表達(dá)趨勢與ALP活性一致，表明微凝膠通過促進(jìn)細(xì)胞黏附與信號通路激活增強(qiáng)成骨潛力。   

圖6. THA-Col基質(zhì)結(jié)合BMP-7 cmRNA的hMSCs成骨分化分析。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了3D打印透明質(zhì)酸-膠原顆粒凝膠（THA-Col微凝膠）作為激活基質(zhì)，用于搭載BMP-7化學(xué)修飾RNA（cmRNA）以促進(jìn)成骨分化。實驗表明，THA-Col微凝膠相比塊狀凝膠展現(xiàn)出更高的細(xì)胞存活率，且能有效支持BMP-7 cmRNA轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）。體外成骨分化實驗顯示，微凝膠可增強(qiáng)堿性磷酸酶（ALP）活性、骨保護(hù)素（OPG）分泌及成骨相關(guān)基因表達(dá)。機(jī)制上，微凝膠的多孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞黏附與信號傳導(dǎo)，協(xié)同cmRNA實現(xiàn)生長因子的內(nèi)源性表達(dá)，避免了傳統(tǒng)蛋白遞送的超生理劑量副作用。本研究證實了cmRNA技術(shù)在骨再生中的潛力，為開發(fā)個性化骨移植替代物提供了新策略，有望減少對自體骨移植的依賴。

文章來源：https://doi.org/10.1002/adhm.202405047