植物細胞3D打印優(yōu)化：兼顧分辨率與細胞活性的策略探索

來源：iBiofabrication

細胞打印技術(shù)為植物組織工程的發(fā)展提供了技術(shù)支撐，在植物細胞微環(huán)境研究、高價值代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、植物基食品制造以及定制化木材合成等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。然而，與已經(jīng)相對成熟的哺乳動物細胞打印相比，植物細胞打印尚處于起步階段，仍面臨如細胞尺寸不均和剪切力敏感等挑戰(zhàn)，難以同時實現(xiàn)高打印分辨率與高細胞活性。

近期，清華大學機械系歐陽禮亮團隊以胡蘿卜細胞為研究對象，系統(tǒng)探討了植物細胞團形態(tài)對生物墨水性能的影響，并提出“植物細胞團尺寸與針頭內(nèi)徑匹配”的策略，旨在為植物細胞的工程化應(yīng)用提供參數(shù)優(yōu)化方案（圖1）。

圖1. 基于胡蘿卜細胞的植物細胞3D打印優(yōu)化策略

工作亮點

• 首次建立適用于擠出打印的植物細胞團-針頭尺寸匹配準則
• 厘米級大尺寸載植物細胞結(jié)構(gòu)的打印與穩(wěn)定培養(yǎng)
• 擠出式打印對植物細胞功能影響的初步解析
  

研究內(nèi)容
基于懸浮培養(yǎng)獲得的細胞團（S-Cell）的墨水活性與均勻性更好。本研究首先從胡蘿卜外植體培養(yǎng)獲得常規(guī)愈傷組織（R-Callus），隨后通過物理破碎獲得離散化愈傷組織（F-Callus），并采用懸浮培養(yǎng)獲得細胞團（S-Cell）。其中S-Cell的尺寸最?。?74±79 μm），活死染色結(jié)果表明，三種細胞形態(tài)的初始存活率均較高（R-Callus ~93%，F(xiàn)-Callus ~85%，S-Cell ~97%），因在制備過程中受機械剪切作用，F(xiàn)-Callus的存活率相對較低（圖2）。

圖2. 不同形態(tài)的胡蘿卜細胞制備與表征

將三種細胞形態(tài)分別與明膠/海藻酸水凝膠混合制備生物墨水。透明度測試顯示，S-Cell墨水均勻性最佳。流變學測試表明，所有墨水均表現(xiàn)出剪切稀化特性，且墨水均保持溶膠-凝膠溫敏轉(zhuǎn)變能力。這對形成擠出微絲單元和打印過程中的結(jié)構(gòu)自支撐至關(guān)重要。在擠出測試中，S-Cell因其均勻性良好和尺寸小的優(yōu)勢，可用內(nèi)徑更小的針頭（24G：310μm）進行擠出（圖3）。

圖3. 生物墨水的制備與理化性質(zhì)表征

在此基礎(chǔ)上，作者通過進一步測試不同規(guī)格針頭（18G-24G）的打印效果發(fā)現(xiàn)，當針頭直徑能覆蓋85%（臨界分數(shù)）以上的細胞團時，生物墨水可以實現(xiàn)穩(wěn)定打?。▓D4）。并且僅S-Cell墨水可順利通過24G針頭實現(xiàn)更高分辨率打?。▓D4）和更高細胞活性（圖5）。

圖4. 生物墨水的打印性能與針頭適配性研究

圖5. 優(yōu)化工藝提高細胞存活率

作者通過活死染色定量分析發(fā)現(xiàn)，在打印后，三種墨水細胞存活率相近，但培養(yǎng)4天后，S-Cell組的細胞活性提高至80%以上，且35天內(nèi)持續(xù)增殖，載細胞結(jié)構(gòu)保持良好形貌和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖5、6）。

圖6. 批量化植物細胞打印及其長期培養(yǎng)

團隊使用S-Cell墨水成功打印出厘米級的“胡蘿卜形狀”結(jié)構(gòu)?；钏廊旧Y(jié)果顯示，不同區(qū)域細胞活性一致，表明3D打印構(gòu)建的多孔結(jié)構(gòu)有助于營養(yǎng)物質(zhì)的均勻交換（圖7）。

圖7. 厘米級胡蘿卜狀結(jié)構(gòu)的生物打印

RNA-seq 分析顯示，打印過程激活了細胞壁修復、防御響應(yīng)、氧化應(yīng)激等基因表達，提示植物細胞能通過自我調(diào)節(jié)應(yīng)對適度的剪切應(yīng)激（圖8）。但若剪切力過強，細胞死亡風險加大。

圖8. 細胞對生物打印過程的應(yīng)激響應(yīng)

總結(jié)與展望
為避免植物細胞在打印過程中，因過高的剪切作用而導致細胞死亡和生長緩慢，本研究首次提出“臨界分數(shù)”作為細胞團-噴嘴匹配的重要準則，為高分辨率與高活性植物細胞打印提供理論依據(jù)與實用指導，并通過RNA-seq分析，初步驗證了在合適的剪切作用下，植物細胞可通過自調(diào)節(jié)，恢復良好的生長狀態(tài)。總結(jié)而言，打印參數(shù)窗口的選擇對植物細胞打印至關(guān)重要。

論文于2025年2月5日發(fā)表于《Biofabrication》，清華大學機械系博士生周德志為第一作者，本科生李佩錫為共同第一作者，歐陽禮亮副教授為通訊作者，其他合作者包括博士生余爽、前科研助理崔鎮(zhèn)華以及深圳清華大學研究院徐弢教授。項目獲得國家自然科學基金的支持。

原文鏈接：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/adada1