3D打印介孔生物玻璃/PCL支架誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，并免疫調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化

來(lái)源：EngineeringForLife

生物陶瓷復(fù)合聚己內(nèi)酯（PCL）支架廣泛應(yīng)用于骨缺損修復(fù)研究。其中，生物活性玻璃（BG）因其特有的無(wú)機(jī)非晶態(tài)結(jié)構(gòu)、生物活性及骨結(jié)合特性，被認(rèn)為是優(yōu)異的骨類修復(fù)材料。然而，普通的BG和介孔BG孔道致密、比表面積低限制了整體支架的機(jī)械性能和生物活性，往往需要增大BG的比例來(lái)掩蓋這些缺點(diǎn)。3D打印可以依據(jù)骨的結(jié)構(gòu)以及骨缺損類型，在成像數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)模型的輔助下，直接逐層制造高度精確的三維實(shí)體，廣泛應(yīng)用于骨組織工程。聚合物和生物陶瓷的3D打印可以極大的滿足支架的性能要求，是目前研究的熱點(diǎn)。

廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所許為康團(tuán)隊(duì)和遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院瓦慶德團(tuán)隊(duì)制備出高比表面積和孔徑的樹枝狀介孔結(jié)構(gòu)生物活性玻璃（MBG）。將不同比例的MBG粉末與PCL混合，應(yīng)用3D 打印機(jī)制備MBG/PCL支架。對(duì)復(fù)合支架進(jìn)行理化性能和免疫協(xié)調(diào)成骨性能研究，從而優(yōu)選具備最佳抗壓強(qiáng)度和成骨活性的MBG比例支架。最后，依據(jù)最佳MBG比例制備出不同纖維直徑和孔徑的MBG/PCL支架，探索纖維粗細(xì)和孔徑在支架理化性能和調(diào)控巨噬細(xì)胞（MP）向M2表型極化并促進(jìn)成骨潛能上的影響。   

1、主要內(nèi)容

圖1 MBG的表征

MBG是由許多納米級(jí)別的小顆粒堆積組合形成的微球，玻璃微球分散性好，表面疏松多孔，孔道呈樹枝狀分布。MBG的N2吸附脫附曲線符合介孔材料的IV型等溫線，經(jīng)過(guò)計(jì)算可得出生物活性玻璃微球的比表面積為457.14m2/g，孔體積為1.38cm3/g，平均孔徑為11.83nm。

圖2 MBG/PCL支架的表面形貌及接觸角

各組支架絲徑粗細(xì)均勻，纖維方向相差90°相互交錯(cuò)。支架表面存在散在孔隙，5MBG/PCL、10MBG/PCL、20MBG/PCL、30MBG/PCL支架表面可見MBG顆粒附著。從高倍鏡下看，支架表面的粗糙度隨著MBG含量的增加而增加，以30MBG/PCL最為顯著。這些粗糙面可以為細(xì)胞提供粘附的位點(diǎn)，更有利于引導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化等行為。此外，MBG的加入改善了PCL材料的親水性，其改善程度與MBG濃度相關(guān)。   

圖3 MBG/PCL支架的理化特性

各組支架均出現(xiàn)PCL的特征峰，其中2850-3000cm-1處–(CH2)4–為CH伸縮振動(dòng)，1750cm-1處是C=O伸縮振動(dòng)峰，1150-1250cm-1代表-C-O-。隨著MBG含量的增加，PCL原有的特征峰逐步降低。通過(guò)對(duì)各組支架進(jìn)行熱重分析，支架剩余無(wú)機(jī)顆粒的質(zhì)量與混入MBG的比例基本一致。在支架的抗壓縮性能測(cè)試中，我們可以看到隨著MBG含量的增加PCL的抗壓能力逐漸增強(qiáng)。以10%最顯著。但在此基礎(chǔ)上，隨著MBG含量的增加支架的抗壓強(qiáng)度逐步下降。20%和30%支架在達(dá)到抗壓峰值后迅速坍塌。這是因?yàn)镻CL包裹MBG顆粒類似于“海-島”結(jié)構(gòu)。我們推測(cè)，當(dāng)MBG（“島”組分）含量進(jìn)一步增大時(shí)，對(duì)PCL（“�！苯M分）的整體連接性能產(chǎn)生了不利的影響，進(jìn)而降低支架的最大抗壓強(qiáng)度。同時(shí)，較大比例的MBG在PCL中團(tuán)聚，使得抗壓形變過(guò)程中受力不均導(dǎo)致支架整體坍塌。   

圖4 MBG/PCL支架的細(xì)胞相容性和成骨性能

BMSCs在各組支架上增殖的OD值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，10MBG/PCL組增殖活性顯著優(yōu)于其他組。在成骨分化早期，5MBG/PCL、10MBG/PCL、20MBG/PCL、組成骨基因（ALP、OPN、BMP2）的表達(dá)量顯著高于0MBG/PCL組，而30MBG/PCL與0MBG/PCL組差異不顯著。在COLI的表達(dá)中則是含MBG的支架顯著高于純PCL組。值得注意的是，相比其他組，10MBG/PCL組支架在上述基因的表達(dá)上調(diào)中最為顯著。在RUNX2的表達(dá)中，10MBG/PCL組同樣顯著高于0MBG/PCL和5MBG/PCL組，而與20MBG/PCL、30MBG/PCL無(wú)顯著差異。成骨誘導(dǎo)14天后，相比其他組，10MBG/PCL組仍最顯著地上調(diào)OPN、RUNX2、BMP2、COLI的表達(dá)。在ALP表達(dá)中，10MBG/PCL和20MBG/PCL顯著優(yōu)于0MBG/PCL組，同時(shí)10MBG/PCL＞30MBG/PCL，而其余各組之間卻無(wú)顯著差異。將BMSCs與支架共培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)7天進(jìn)行ALP定量分析，10MBG/PCL組支架ALP表達(dá)量最高，而其余各組之間差異不顯著，這也與ALP染色的結(jié)果一致。綜上所述，在PCL材料中摻入MBG，可以增強(qiáng)其體外成骨性能，其中以10MBG/PCL支架的促BMSCs成骨分化性能最為優(yōu)異。研究表明，BG釋放的Si2+、Ca2+、P5+離子在與BMSCs等細(xì)胞接觸過(guò)程中會(huì)調(diào)控細(xì)胞周期并上調(diào)或激活成骨基因的表達(dá)，且納米尺寸的BG具備更強(qiáng)的生物活性，尺寸較小的生物玻璃促使細(xì)胞由G0/G1期向S/G2期能力更強(qiáng)，而尺寸大的生物玻璃使得更大比例的細(xì)胞保持在G0/G1期。這可能是含量20%、30%MBG支架增殖活性顯示較低的原因（MBG在PCL表面團(tuán)聚）。

圖5 MBG/PCL支架的免疫調(diào)控性能

10MBG/PCL支架上調(diào)巨噬細(xì)胞M2型基因（CD206、ARG）表達(dá)以及抑制M1型基因（TNF-α、IL-1β）表達(dá)的性能最顯著。相比與純PCL支架，MBG賦予了PCL一定的促M(fèi)P向M2表型極化的能力。為了評(píng)價(jià)支架介導(dǎo)MP的M2極化促進(jìn)BMSCs成骨分化的潛能，在各組支架中加入相應(yīng)的MP條件培養(yǎng)基進(jìn)行促BMSCs成骨分化研究。MP條件培養(yǎng)基下10MBG/PCL組上調(diào)成骨相關(guān)基因（ALP、RUNX2、OPN、COLI、BMP-2）的表達(dá)最顯著，ALP染色和定量同樣如此。我們推測(cè)這與MBG的劑量相關(guān)，更高濃度的MBG可能會(huì)延長(zhǎng)MP向M1極化的過(guò)程，表達(dá)更多的M1表型基因TNF-α和IL-1β，不利于炎癥的清除。

圖6 F300、F500、F800表面形貌和理化性能

以10MBG/PCL支架為模板設(shè)定3D打印參數(shù)。打印統(tǒng)一孔徑500um，不同纖維直徑（300um、500um、800um）的三組支架，分別標(biāo)記為F300、F500、F800。支架的親水性和抗壓強(qiáng)度以F500最佳。當(dāng)纖維直徑減少200um，支架的抗壓性能則降低15.72MPa。纖維直徑增加300um，支架的抗壓性能則上升4.28MPa。更粗的纖維增加了支架的受力面積，因此整體表現(xiàn)為支架的抗壓能力隨著纖維的增粗而增強(qiáng)。三組支架的孔隙率則與抗壓性能相反，相比F500，F(xiàn)300的孔隙率增加1.73%，而F800則下調(diào)了6.06%。  

圖7 P200、P500、P800表面形貌和理化性能圖片

打印統(tǒng)一纖維直徑500um，不同孔徑（200um、500um、800um）的支架，分別標(biāo)記為P200、P500、P800。P500的接觸角最大，而P200和P800的接觸角無(wú)顯著差異。支架的孔徑越大孔隙率越高，同時(shí)，支架的抗壓強(qiáng)度隨著孔徑增大而下降。這可能是孔徑的增寬降低了支架的受力面積，進(jìn)而導(dǎo)致抗壓能力的減弱。   

圖8 F300、F500、F800細(xì)胞增殖活性和成骨性能

BMSCs能在不同纖維直徑支架上定植，其中F500的熒光數(shù)量最多，其次為F800，這與細(xì)胞增殖的OD值梯度相符。這是由于纖維越細(xì)單位面積內(nèi)絲徑數(shù)目越多，能為細(xì)胞提供更多的粘附位點(diǎn)。但是，由于F300相對(duì)弧度較大，反而最不利于細(xì)胞早期粘附。細(xì)胞粘附的差異同樣反應(yīng)在成骨性能上，F(xiàn)500上調(diào)成骨基因（ALP、RUNX2、OPN、COLI、BMP-2）的表達(dá)最為顯著，F(xiàn)300次之，最低的是F800。然而，在ALP染色和定量中雖然仍以F500最佳，但是F800、F300卻無(wú)顯著差異。

圖9 F300、F500、F800促RAW264.7細(xì)胞極化和免疫調(diào)控成骨性能

在炎癥基因的表達(dá)中，較粗的纖維和較大的孔徑似乎更有利于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和沉積，傾向于修復(fù)表型M2基因（CD206、ARG）的表達(dá)。F500顯著抑制了M1型基因（TNF-α、IL-1β）的表達(dá)，F(xiàn)300卻顯著上調(diào)M1型基因，然而在第3天的TNF-α表達(dá)中F800＞F300。然而，F(xiàn)300誘導(dǎo)MP極化為M2的性能要優(yōu)于F800，這可能是同等面積下，F(xiàn)300的纖維交叉較多，有利于MP的拉伸，促進(jìn)M2極化。在MP條件培養(yǎng)基的介導(dǎo)下，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，F(xiàn)500促進(jìn)成骨基因（ALP、OPN、BMP-2、COLI）的表達(dá)上調(diào)最為顯著。在RUNX2的表達(dá)中，第7天F500顯著高于F800，與F300無(wú)顯著差異。第14天，F(xiàn)300優(yōu)于F800，但F500與其余兩組未表現(xiàn)出差異。F300和F800在ALP的染色和定量中未出現(xiàn)顯著差異，F(xiàn)500能顯著的促進(jìn)ALP分泌�？偟膩�(lái)說(shuō)，在免疫調(diào)控成骨性能上，F(xiàn)500>F300>F800。

圖10 P200、P500、P800細(xì)胞增殖活性和成骨性能

將支架與BMSCs共培養(yǎng)，在第1天的增殖中，P800的OD最高，P200與P500無(wú)顯著差異。而在3、7天，P500的細(xì)胞增殖活性顯著上調(diào)�？傮w上，BMSCs的增殖活性P500>P800>P200。在共培養(yǎng)三天后的熒光染色中，我們同樣可以看到這樣的趨勢(shì)。在第7天的ALP染色和定量中，我們可以看到P500具有最顯著的ALP表達(dá)效果。在成骨基因ALP、OPN、RUNX2、BMP-2、COLI的表達(dá)中，P500的上調(diào)性能最顯著。較小的孔徑不利于成骨組織表型的功能分化，足夠大（＞250um）的孔徑利于骨的礦化。而P500具備最顯著的成骨潛能，這可能是纖維直徑500um、孔徑500um的支架處于理化性能、細(xì)胞粘附和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換之間最佳的平衡狀態(tài)。   

圖11 P200、P500、P800促RAW264.7細(xì)胞極化和免疫調(diào)控成骨性能

如圖11所示，大孔徑似乎更能促進(jìn)MP向M2表型極化。相比P300，P500和P800顯著上調(diào)CD206和ARG的表達(dá)，同時(shí)，第一天的ARG表達(dá)P500＞P800，而其他情況下P500和P800無(wú)顯著差異。P200誘導(dǎo)炎癥基因（TNF-α、IL-1β）的表達(dá)最顯著，P800次之，P500顯示出顯著的抑制效果。P200和P800促M(fèi)P極化的能力弱于P500，這可能也是支架性能和細(xì)胞滲透未達(dá)到最佳平衡所致。在MP條件培養(yǎng)基的介導(dǎo)下，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，P500顯著上調(diào)成骨基因的表達(dá)，P800的體外免疫成骨性能要優(yōu)于P200。同樣的，在ALP的染色和定量中，P500表現(xiàn)最顯著的活性。   

2、總結(jié)與展望
我們合成了高活性的MBG，提升了PCL支架整體的抗壓性能和生物活性。其中10MBG/PCL具備最高的抗壓強(qiáng)度（約是純PCL支架的2倍）和最優(yōu)異的體外誘導(dǎo)成骨活性。10MBG/PCL支架顯著的抑制了MP的M1表型極化過(guò)程，上調(diào)M2抗炎表型基因。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，支架的理化性能和成骨活性同時(shí)受纖維粗細(xì)和孔徑大小的影響。然而，支架的孔徑大小比纖維粗細(xì)更能誘導(dǎo)MP的極化�？傊�，纖維直徑500um、孔徑500um的10MBG/PCL支架具備最佳的成骨潛能，能顯著誘導(dǎo)MP向M2表型極化，且該組最能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，形成利于骨再生的免疫微環(huán)境。本研究向BG復(fù)合PCL支架性能的探索邁進(jìn)了一步，為骨移植材料的研發(fā)提供了新的思路。

參考資料：https://doi.org/10.36922/ijb.3551