華南理工曹曉東團隊：用于軟骨再生的載干細胞3D打印絲素蛋白/明膠支架

來源： EFL生物3D打印與生物制造

關節(jié)軟骨組織一經運動損傷或疾病很難實現自愈，目前治療軟骨缺損的方法有骨髓刺激、自體骨軟骨移植、基質誘導自體軟骨細胞修復手術等，但這些方法仍存在供體不足、纖維軟骨再生等問題。因此，如何有效的修復軟骨損傷仍是一大挑戰(zhàn)。近期，來自華南理工的曹曉東教授團隊采用擠出式低溫3D打印技術，通過辣根過氧化物酶( HRP )介導絲素蛋白( SF )和酪胺改性明膠( GT )交聯，制備了多孔水凝膠支架，并結合干細胞聚集體接種實現促進II型膠原高表達，向透明軟骨分化，提升關節(jié)軟骨再生修復效果。相關論文“3D printed silk-gelatin hydrogel scaffold with different porous structure and cell seeding strategy for cartilage regeneration”發(fā)表于雜志Bioactive Materials上。

首先，研究人員通過利用3D打印技術并結合明膠溫敏性和雙氧水浸泡成膠方式制備了具有連通孔結構的3D打印水凝膠支架（圖 1），且采用光學顯微鏡和掃描電鏡（SEM）評估了3D打印水凝膠支架表面和橫截面的形態(tài)（圖2）。

圖1 3D打印水凝膠支架合成示意圖

圖2 3D打印水凝膠支架表面和橫截面圖

為分析SF-GT水凝膠的力學性能，研究人員通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和壓縮實驗證實了3D打印水凝膠支架具有良好的抗壓縮和抗疲勞特性，可為組織工程軟骨發(fā)揮支撐作用（圖3）。

圖3 不同3D打印水凝膠支架的FTIR光譜

隨后，研究人員通過加入絲素蛋白并引發(fā)其分子構象轉變提升了水凝膠的力學性能、延長了降解時間，同時保有較高的孔隙率，各項理化性能測試均顯示了SF5GT15/醇處理支架最適合作為軟骨組織再生支架材料，并采用活/死染色法驗證了SF-GT水凝膠支架具有良好的生物相容性（圖4）。

圖4 不同水凝膠支架的理化性能測試

其次，研究人員開發(fā)了具有貫通孔(TH)和錯位孔(SH)的兩種支架，實驗結果表明改變支架內部纖維絲的空間排列，可成功打印出錯位孔支架和貫通孔支架，這兩種支架在孔隙率和力學性能上沒有顯著性差異，但錯位孔可提高細胞接種效率（圖5）。

圖5 水凝膠支架內部結構的電鏡掃描圖

接著，研究人員對比了細胞懸液(CS)和細胞聚集體(CA)兩種細胞接種方法，發(fā)現細胞聚集體接種可以使細胞有效地滲透到支架中，獲得細胞在整個結構中的空間分布，從而形成高質量的基質組織（圖6），并通過體外成軟骨誘導實驗證明，在相同誘導條件下，以細胞聚集體接種的方式，有利于維持圓形形態(tài)干細胞的聚集，促進干細胞表達并分泌較多的 II 型膠原，有利于干細胞向透明軟骨分化；而以細胞懸液接種的方式，干細胞表達并分泌更多的 I 型膠原，干細胞傾向于向纖維軟骨分化（圖7、圖8）。

圖6 細胞活/死染色

圖7 體外培養(yǎng)的CA/SH和CS/SH軟骨形成

圖8 3D打印水凝膠支架上CS和CA的軟骨分化

最后，研究人員通過兔關節(jié)軟骨缺損模型評估了負載干細胞聚集體的錯位孔支架對軟骨缺損修復的作用，對比了12周和16周的修復情況（圖9）以及多種組織學染色結果（圖10），表明了采用細胞聚集體接種的錯位孔支架可有效實現關節(jié)軟骨的再生修復。

圖9 體外動物實驗

圖10 體內再生軟骨的組織學評估

綜上所述，本研究通過將3D打印的SF-GT水凝膠和干細胞聚集體結合，開發(fā)了一種有效的軟骨組織工程方法，構建了理化性能高度仿生的軟骨組織工程支架，還設計了體外實驗來評價組織工程軟骨的形成，最后通過體內研究表明，采用細胞聚集接種法制備的3D打印SF5GT15水凝膠在促進軟骨再生修復方面具有廣闊的臨床應用前景。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.03.013