《Biofabrication》綜述：是否可以對(duì)承重骨植入物進(jìn)行 生物3D 打��？

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任何組織工程支架的康復(fù)能力主要取決于以下三方面：(i) 生物力學(xué)特性，如機(jī)械特性和結(jié)構(gòu)；(ii) 化學(xué)特性，如細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控；(iii) 細(xì)胞反應(yīng)調(diào)控（包括細(xì)胞招募和分化）。植入物越接近原生組織，就越能修復(fù)其中的損傷。在現(xiàn)有的制造技術(shù)中，只有3D生物打印（3DBP）能令人滿意地復(fù)制宿主組織固有的異質(zhì)性。然而，3D生物打印支架通常具有較差的機(jī)械性能，因此，近年來(lái)人們對(duì)開(kāi)發(fā)承重3D生物打印骨科支架的研究興趣日益濃厚。通常情況下，這些支架涉及多材料3D打印，至少包括一種生物墨水和一種承重墨水；這樣生物材料的機(jī)械和生物要求就可以分離。在所有這些研究中，確保高細(xì)胞存活率和良好的機(jī)械性能是關(guān)鍵問(wèn)題。由于打印能力的限制和材料庫(kù)的限制，此類(lèi)支架的 3DBP 尚處于早期開(kāi)發(fā)階段，只有少數(shù)初步動(dòng)物研究的研究數(shù)據(jù)可用。

來(lái)自印度馬尼帕爾大學(xué)的Sanchita Bandyopadhyay-Ghosh和來(lái)自加拿大多倫多大學(xué)的Mohini Sain團(tuán)隊(duì)合作從專(zhuān)題角度對(duì)當(dāng)前的3DBP的最先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行了綜述，同時(shí)著重介紹了可用的 3DBP 技術(shù)、生物材料的可打印性、機(jī)械和降解行為，以及它們?cè)诠墙M織康復(fù)方面的整體功效。本工作集綜合并批判性地分析了針對(duì)承重支架的 3DBP 研究，以滿足個(gè)性化醫(yī)療的需求。本工作重點(diǎn)介紹了采用熱塑性塑料和磷酸鹽水泥進(jìn)行承重應(yīng)用的 3DBP 技術(shù)的最新進(jìn)展。最后，本工作展望了 3DBP 在骨科承重應(yīng)用領(lǐng)域的未來(lái)前景。總之，這篇文章為未來(lái)的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，因?yàn)樗�收集了科學(xué)家們可以利用的最新和正在進(jìn)行的研究。相關(guān)工作以題為“Is it possible to 3D bioprint load-bearing bone implants? A critical review”的文章發(fā)表在2023年9月19日的國(guó)際著名期刊《Biofabrication》。

1. 內(nèi)容
最近的開(kāi)發(fā)出了一種 “雙相支架”，其中包括與傳統(tǒng)生物墨水一起打印的機(jī)械強(qiáng)度（或承重）階段，從而在一定程度上復(fù)制了骨組織的原生環(huán)境。幾乎所有此類(lèi)支架中的堅(jiān)硬相都由低溫熔融熱塑性生物聚合物或磷酸鹽水泥組成，并配制成可擠出的糊狀物。與傳統(tǒng)的生物陶瓷不同，這些水泥可以在溫和的條件下凝固或固化。圖 1(a) 定性比較了雙相支架與生物打印和無(wú)細(xì)胞 3DP 支架的特性。雙相支架代表了3D生物打印（3DBP）在化學(xué)和生物仿真之間的一種更好的平衡以及在細(xì)胞 3DP 支架上觀察到的機(jī)械剛度、打印分辨率和支架穩(wěn)定性。雙相支架的壓縮模量大約是傳統(tǒng) 3DBP 支架的 1000 倍（圖 1(b)）。

圖1 機(jī)械性能、超微結(jié)構(gòu)（代表形態(tài)擬態(tài)和打印分辨率）、穩(wěn)定性（在生理介質(zhì)中）的定性比較

【用于承載應(yīng)用的 3DBP 技術(shù)】

在各種技術(shù)中，基于擠壓的多材料生物打印技術(shù)（圖 2(a)和(b)）是最簡(jiǎn)單易行的，而且可以找到相對(duì)便宜的臺(tái)式生物打印機(jī)型號(hào)，因此得到廣泛采用。然而，基于擠壓的生物打印機(jī)打印速度慢，打印分辨率低（通常大于幾百微米）。相比之下，基于 SLA 和噴墨的生物打印機(jī)理論上可以實(shí)現(xiàn)更高的生物墨水打印分辨率（通常小于 50 微米）。迄今為止，已有報(bào)道稱(chēng)噴墨或 SLA 型多材料混合生物打印機(jī)采用熔融擠出技術(shù)打印熱塑性承重墨水，并通過(guò)噴墨打印頭（圖 2(d)-(f)）或 SLA 光聚合技術(shù)（圖 2(c)）打印生物墨水。

圖2 通過(guò)熔融擠出和三種生物墨水打印 PCL 的多材料 3D 生物打印機(jī)的結(jié)構(gòu)原理

【帶熱塑性塑料的 3DBP】
聚乳酸-共聚乙醇酸（PLGA）、聚乳酸（PLA）和聚苯乙烯（PCL）等熱塑性生物材料早已被公認(rèn)為具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景的材料。它們的3D打印性和生物降解性進(jìn)一步提高了它們的聲譽(yù)。此外，這些生物材料還具有良好的機(jī)械性能，因此過(guò)去曾被用于工程承重組織構(gòu)建。盡管如此，原始熱塑性生物聚合物缺乏足夠的生物活性，而且 3DP 所需的溫度可能會(huì)誘發(fā)細(xì)胞毒性效應(yīng)。盡管如此，最近的文獻(xiàn)報(bào)道了使用熱塑性聚合物作為承重相的 3DBP 承重植入物的成功嘗試。從本質(zhì)上講，使用熱塑性聚合物對(duì)承重植入體進(jìn)行 3DBP 需要熱塑性聚合物（通過(guò)熔融擠出）與至少一種生物墨水相結(jié)合的多材料 3D打印技術(shù)。

【含磷酸鹽水泥的 3DBP】
MgP 是另一類(lèi)可能替代 CPC 的水泥，因?yàn)槠錂C(jī)械強(qiáng)度更高，體內(nèi)固化和降解速度相對(duì)更快。Kanter 等人報(bào)告了一項(xiàng)在成年綿羊股骨髁上對(duì)基于硬石膏、刷狀石和 CDHA 的水泥進(jìn)行為期 10 個(gè)月的比較研究。如圖 3 所示，與兩種 CaP 骨水泥相比，基于 MgP 的閃長(zhǎng)巖骨水泥表現(xiàn)出更大的骨吸收率和相應(yīng)更高的新骨生長(zhǎng)率。鎂磷酸鹽水泥通常包括固體鎂前體，使用可溶性磷酸鹽（如磷酸氫二銨，DAHP和磷酸氫二鉀，DKHP）固化，生成不溶性的鎂磷酸鹽水泥。

圖3 在成年綿羊股骨髁中植入 10 個(gè)月的基于硬石膏、刷石和 CDHA 的水泥樣品的生物反應(yīng)

近年來(lái)的一些研究重點(diǎn)是在溫和條件下打印高硬度磷酸鹽水泥基支架，使其(a)可攜帶生物分子，(b)可與活組織一起打印。這種工程解決方案有可能以整體方式復(fù)制原生骨組織，并有效修復(fù)骨組織。在此階段，本研究想說(shuō)明的是，由于固化磷酸鹽水泥的高硬度，使用水泥漿作為細(xì)胞系的載體可能并不可取。圖 4 描述了用于 BTE 的基于磷酸鹽水泥的 3D 打印支架的簡(jiǎn)化制造和植入工作流程，以及磷酸鹽水泥墨水和此類(lèi)技術(shù)中使用的含細(xì)胞生物墨水的主要特征。隨后的章節(jié)將詳細(xì)討論正在開(kāi)發(fā)的兩類(lèi)重要的磷酸鹽水泥，以實(shí)現(xiàn)這種高硬度 BTE 支架的 3DBP。

圖4 骨組織工程中磷酸鹽水泥基3D打印支架的合成和植入典型工作流程示意圖

Ahlfeld 等人推進(jìn)了制備硬質(zhì)3D生物打印雙相 BTE 支架的技術(shù)。如圖 5（a）所示，他們利用多材料共擠打印油基 CPC 油墨和攜帶間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的藻酸鹽生物墨水。在打印過(guò)程中，兩相的存在并未對(duì)單個(gè)油墨的行為產(chǎn)生重大影響。支架的固化分為兩個(gè)階段：（a）在高濕度環(huán)境中固化 CPC 表面；（b）在 CaCl2 溶液中固化海藻酸鹽生物墨水和 CPC 主體。這兩個(gè)步驟旨在防止 CPC 階段形成微裂縫。將 CPC 直接浸入水浴中固化會(huì)導(dǎo)致殘余應(yīng)力，并在固化反應(yīng)期間形成裂縫。另一方面，最初暴露在濕氣中超過(guò) 30 分鐘會(huì)導(dǎo)致 CaP 逐漸沉淀。暴露表面的局部固化固定了打印支架的初始形狀。在水浴中的進(jìn)一步培養(yǎng)完成了固化過(guò)程，增加了水分滲透，降低了殘余應(yīng)力，使表面沒(méi)有微裂縫，并顯著提高了打印支架的抗壓強(qiáng)度。總體而言，雙相支架的壓縮模量大于 30 兆帕，壓縮強(qiáng)度為 1.3 兆帕，均大大高于傳統(tǒng)的生物打印支架。

圖5 通過(guò)多材料共擠出生物打印進(jìn)行 3DBP 的典型工作流程以及噴嘴的改進(jìn)

雙相支架的體外細(xì)胞相容性顯示，在大多數(shù)生物墨水中，CPC 墨水不會(huì)引起毒性（由于油載體釋放或凝固反應(yīng)）。然而，一天后在兩種油墨的界面處觀察到大量細(xì)胞死亡（圖 6(a)）。這歸因于凝固反應(yīng)過(guò)程中氫離子的釋放。長(zhǎng)期研究表明，細(xì)胞相容性有所改善，培養(yǎng) 21 天后，細(xì)胞在 CPC 相上大量生長(zhǎng)，并隨之遷移和增殖（圖 6（a）和（b））。經(jīng)優(yōu)化的初始支架培養(yǎng)時(shí)間（<30 分鐘）可在細(xì)胞增殖和支架強(qiáng)度之間取得良好的平衡。由于藻酸鹽油墨本身的打印適性較差，打印樣品的孔隙閉合是由于無(wú)支撐的支柱塌陷造成的，可能會(huì)阻礙細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。選擇更好的生物墨水（如硬度更高的水凝膠）可能會(huì)增強(qiáng)3D生物打印支架的體外行為，因?yàn)檫@樣可以打印出更大的孔，最大限度地減少 CPC 與生物墨水之間的界面，并相應(yīng)地提高支架培養(yǎng)初期的細(xì)胞存活率。此外，這項(xiàng)工作還通過(guò)開(kāi)發(fā)患者特異性生物墨水得到了擴(kuò)展，將直接取自患者的血漿融入其中。通過(guò)這種方法向缺損部位輸送免疫調(diào)節(jié)蛋白，有望引起有利的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)受損組織的愈合能力。

圖6 基于CPC和藻酸鹽生物墨水的雙相3D打印支架的體外結(jié)果顯示

【對(duì) 3DBP 承重生物材料的嚴(yán)格評(píng)價(jià)】

由于 CaP 基 3DP 油墨與原生骨的礦物相類(lèi)似，因此在開(kāi)發(fā)承重 3DBP 支架方面，對(duì) CaP 基 3DP 油墨的研究相對(duì)多于鎂基 3DP 油墨。CaP 墨水的生物降解發(fā)生在（a）溶液驅(qū)動(dòng)的溶解和（b）破骨細(xì)胞介導(dǎo)的吸收（圖 7(a)）。在固化 CPC 中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)主要相中，磷灰石相是生理 pH 值下熱力學(xué)上最穩(wěn)定的相。因此，它們主要通過(guò)破骨細(xì)胞活動(dòng)被吸收。盡管這種吸收相對(duì)要慢得多，但破骨活動(dòng)會(huì)形成獨(dú)特的 “豪西普裂隙”。由于其有利的界面，這些吸收部位可以成為新骨形成的熱點(diǎn)。此外，CPC 中的離子置換已被證明可控制破骨細(xì)胞的活性，即Sr2+ 離子可通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP 1 和 2）的分泌來(lái)抑制破骨細(xì)胞的活性。因此，吸收的減少有助于提高整體骨修復(fù)率。另外，碳酸根離子取代的磷灰石顯示出更快的降解潛力，從而加速了吸收過(guò)程。順便提一下，Innotere 小組報(bào)告的 3D 打印 CaP 墨水中含有一定量的碳酸鈣，從而緩解了 CDHA 降解速度慢的問(wèn)題。圖 8 總結(jié)了文獻(xiàn)中報(bào)道的用于開(kāi)發(fā)骨科用承重 3DBP 支架的各類(lèi)材料（承重生物材料墨水和生物墨水）和生物打印技術(shù)。

圖7 CaP 生物材料植入后的命運(yùn)以及 PCL 中觀察到的降解模式

圖8 承重 3D 生物打印材料和生物打印方法概述

當(dāng)然，為了開(kāi)發(fā)有效的 BTE 支架，需要研究骨生物礦化的相關(guān)機(jī)制。在原生骨中，礦化過(guò)程以軟骨內(nèi)骨化為主。雖然膠原基質(zhì)是礦物質(zhì)沉積的模板，但人們普遍認(rèn)為非膠原蛋白（NCP），包括糖蛋白和蛋白聚糖在調(diào)節(jié)生物礦化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。除了在膠原纖維的間隙區(qū)域引導(dǎo)礦物相的自組裝之外。NCP 帶有大量負(fù)電荷，可與無(wú)定形磷酸鈣（ACP）形成蛋白質(zhì)-礦物質(zhì)復(fù)合物。這些帶負(fù)電荷的復(fù)合物具有以下優(yōu)點(diǎn)：(i) 可防止 HA 在間隙部位沉淀，(ii) 為 ACP 在纖維內(nèi)向膠原縫隙區(qū)帶正電荷的 N 端滲透提供靜電勢(shì)。圖 9 展示表示了這一機(jī)制，并附有未礦化和完全礦化膠原纖維的 TEM 圖像。

圖9 NCP 介導(dǎo)的膠原蛋白礦化的圖示和具有 ACP 復(fù)合物的未礦化膠原原纖維的 TEM 圖像

【展望未來(lái)】

相比之下，使用 CaP 粘合劑進(jìn)行 3D 打印則面臨不同的挑戰(zhàn)，例如，由于水介質(zhì)的打印窗口較短，因此不能可靠地用作載體介質(zhì)。因此，有一些涉及油基 CPC 油墨的研究報(bào)告稱(chēng)，這種油墨與含有細(xì)胞的生物墨水一起打印時(shí)具有極佳的可打印性。雖然這些研究顯示了良好的細(xì)胞相容性和體外培養(yǎng)過(guò)程中出色的細(xì)胞增殖能力，但迄今為止還沒(méi)有研究能夠證明這種雙相支架的再生能力。Ahlfeld 等人在最近的一項(xiàng)研究中嘗試在 Lewis 大鼠的顱面缺損中測(cè)試雙相 CPC 支架的體內(nèi)修復(fù)能力，結(jié)果令人欣喜（圖 10）。然而，由于打印技術(shù)的分辨率限制，作者未能使用多通道打印技術(shù)打印出足夠小的部件。解決這一問(wèn)題的可能替代方法是使用多軸核/殼打印技術(shù)，Raja 和 Yun 在其他地方也報(bào)告了這一方法。盡管如此，多材料擠壓3D打印的低打印分辨率問(wèn)題依然存在，并對(duì)復(fù)雜解剖形狀部件的3D生物成型技術(shù)提出了巨大挑戰(zhàn)。

圖10 從顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描數(shù)據(jù)獲得的重建圖像、熒光圖像以及外植體組織切片的光學(xué)顯微鏡圖像

2. 總結(jié)
3DBP 因其卓越的再生能力而在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域得到廣泛認(rèn)可。然而，3DBP 支架的機(jī)械性能和穩(wěn)定性較差是其顯著的缺點(diǎn)，也是其轉(zhuǎn)化研究的主要挑戰(zhàn)。在現(xiàn)有的制造技術(shù)中，承重 3DBP 支架已成為一種可行的解決方案，它可以仿生本地組織的異質(zhì)性，同時(shí)改善骨科應(yīng)用中組織工程構(gòu)建物的機(jī)械性能。用于承重應(yīng)用的 3DBP 可以理解為 “多材料” 3D 打印，其中至少有一種打印墨水是承重相，與其他生物墨水一起進(jìn)行 3D 打印，從而使承重相的打印和凝固/固化過(guò)程在溫和的條件下進(jìn)行，而不會(huì)對(duì)打印的活組織和生物分子的活力產(chǎn)生不利影響。嚴(yán)格的材料和加工要求嚴(yán)重限制了可使用的承重生物材料油墨類(lèi)型。迄今為止，只有熱塑性塑料和磷酸鹽水泥基油墨被報(bào)道為可行的候選材料，其中磷酸鹽水泥基油墨因其成骨性、高硬度和優(yōu)異的降解性能而成為近年來(lái)的首選。盡管如此，該領(lǐng)域仍處于早期發(fā)展階段，在嘗試臨床試驗(yàn)之前，需要解決打印分辨率低、材料庫(kù)有限、機(jī)械強(qiáng)度不達(dá)標(biāo)等挑戰(zhàn)。具備高度多學(xué)科技能的實(shí)驗(yàn)室和監(jiān)管協(xié)議的建立對(duì)于將此類(lèi)3D生物打印承重支架轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐至關(guān)重要。本綜述旨在整合不同領(lǐng)域的相關(guān)信息，從而為支持該領(lǐng)域的未來(lái)研究奠定基礎(chǔ)�？傊�，本綜述相信承重式 3DBP 有足夠的潛力來(lái)應(yīng)對(duì)個(gè)性化醫(yī)療中尚未解決的挑戰(zhàn)，從而實(shí)現(xiàn)高效的骨康復(fù)。隨著時(shí)間的推移，預(yù)計(jì)該技術(shù)將足夠成熟，能夠在臨床環(huán)境中修復(fù)骨組織缺損以及進(jìn)行全骨置換。

文章來(lái)源：

https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acf6e1