浙江大學賀永教授等：周圍神經(jīng)再生和脊髓損傷修復3D打印支架研究進展

來源：極端制造 IJEM
作者：Editorial Office

復雜的神經(jīng)解剖結構導致長距離周圍神經(jīng)再生和脊髓損傷修復一直是一個巨大挑戰(zhàn)。生物支架通過支架結構和種子細胞提供仿生天然組織的結構和功能，可加速神經(jīng)再生過程，而3D打印技術的迅猛發(fā)展使研究人員能夠開發(fā)具有復雜結構和功能多樣的新型3D支架，實現(xiàn)結構和功能的高度仿生。

近期，浙江大學機械學院賀永教授、東莞理工學院特聘副教授宋菊青等人在SCI核心期刊《極端制造》（International Journal of Extreme Manufacturing, IJEM）上發(fā)表了題為《Advances in 3D printing scaffolds for peripheral nerve and spinal cord injury repair》的綜述。論文概述了周圍神經(jīng)和脊髓的解剖結構，以及目前臨床上周圍神經(jīng)損傷（PNI）和脊髓損傷（SCI）的治療策略。然后討論了周圍神經(jīng)和脊髓組織工程的設計要素，并詳述了適用于神經(jīng)組織工程的多種3D打印技術。最后重點介紹了3D打印技術在周圍神經(jīng)再生和脊髓修復中的應用，包括誘導神經(jīng)分化、制造神經(jīng)引導導管、建立脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡和構建脊髓樣支架（如圖1），以及該研究領域的挑戰(zhàn)和前景。

亮點
系統(tǒng)概述了神經(jīng)系統(tǒng)的解剖結構、神經(jīng)損傷的當前治療策略以及神經(jīng)損傷修復支架的設計要素。
探討了擠出打印、立體光固化和面投影打印等3D打印工藝如何有效的構建神經(jīng)損傷修復支架。
歸納總結了3D打印支架在周圍神經(jīng)再生和脊髓損傷修復中的最新應用，可以為組織工程神經(jīng)修復和再生提供新的思路。

圖1 神經(jīng)支架的設計要素、適用的3D打印技術和典型應用

研究背景
神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能導致神經(jīng)橫斷和血神經(jīng)屏障破壞，最終導致疼痛、感覺障礙和身心損傷。神經(jīng)橫斷會導致神經(jīng)元與其支持細胞之間的通訊中斷。所有這些損傷都可能發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）和周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）中，而它們的神經(jīng)元對軸突橫斷的響應在其根本上是不同的。PNS在損傷后具有先天性再生潛力，但對于間隙長度大于10 mm的缺陷，神經(jīng)再生不會自發(fā)發(fā)生。目前，修復長間隙周圍神經(jīng)損傷（PNI）的臨床標準是使用自體移植物。然而，仍存在一些局限性，如供體來源短缺、大小不匹配和對供體部位的永久性損傷等。與PNS不同，CNS中橫斷的軸突只能產(chǎn)生功能不足的發(fā)芽，而這幾乎不能提供功能恢復。目前，通過藥物治療和康復訓練進行姑息性功能恢復是首選。然而，這些方法既不能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷，也不能恢復運動能力。組織工程技術旨在使用工程方法（包括支架、細胞以及生物物理和生物化學信號）來替換、修復或再生受損、退化或有缺陷的組織，并在周圍神經(jīng)和脊髓再生方面顯示出潛在的優(yōu)勢。而3D打印技術能夠為設計和制造組織工程支架提供所需的空間精度，可以模擬組織結構和材料靈活性，以匹配天然組織的機械和化學特性。3D打印技術使用可固化的材料和計算機控制的工作系統(tǒng)，在設定的數(shù)字模型指導下，逐層構建3D結構，可以很容易地獲得包含生物材料、多種細胞和/或生長因子的精細幾何分布，并可以提供個性化的患者特異性治療選擇。本文對適用于神經(jīng)組織工程的3D打印技術及其典型應用進行了詳細的介紹和總結。

最新進展
3.1. 適用于神經(jīng)組織工程支架的3D打印技術
3D打印是一系列靈活的增材制造技術，可以精確地構建具有復雜3D特征的結構。它在設計靈活性、個性化定制、結構可靠性和適用材料的多樣性方面具有很大的優(yōu)勢。作者總結了神經(jīng)組織工程中廣泛使用的3D打印方法，包括噴墨打印、擠出打印、立體光固化、面投影技術和一些新興的3D打印技術。

噴墨打印能夠以高度可控的方式沿著 x、 y 和 z 軸沉積微小的聚合物溶液液滴，層層累積后在基板上生成所需圖案。在成型過程中，墨水材料必須保持液態(tài)，以便能夠形成液滴并在沉積后立即凝固，從而形成一個3D 結構的支架。噴墨打印技術結合了數(shù)據(jù)驅(qū)動和非接觸方法，能夠使精確體積的墨水以高速和準確的方式沉積在目標位置。目前有多種類型的噴墨打印，如基于熱能機制、壓電機制等（圖2a）。用于生物打印的噴墨技術已經(jīng)成功地打印了液體生物墨水，在微米尺度分辨率下，可以同時沉積不同類型的材料和細胞并精準定位。噴墨生物打印在打印分辨率上具有一定的優(yōu)勢，已有研究表明，按需噴墨打印可以用來精確地沉積細胞而不犧牲其活力，對細胞的精確定位可以促進精細神經(jīng)網(wǎng)絡的建立。噴墨打印技術的主要問題是細胞或材料可能會堵塞打印頭的噴嘴，這可能會產(chǎn)生熱應力、機械應力等，從而損傷細胞。為了防止噴嘴堵塞，墨水必須具備低粘度和低細胞密度。這些條件的控制反過來又導致打印過程中的其他限制（如液滴擴散、細胞沉淀等)。

擠出打印是在計算機控制下，通過可移動打印頭上的噴嘴逐層沉積材料實現(xiàn)的（圖2b)。它分為基于熔融和基于溶液兩種打印方法。擠出打印技術是應用最廣泛的構建載細胞的3D結構的技術之一，它使用活塞或螺桿不斷擠出生物墨水。擠壓產(chǎn)生的壓力和剪切力是造成細胞損傷的主要原因，因此需要對打印參數(shù)（細胞密度、生物墨水粘度、溫度、氣壓等）進行優(yōu)化，以防止細胞凋亡。這種生物打印方法的最大優(yōu)點是可以打印細胞密度較高的粘性生物墨水，這是其他打印技術不易達到的。另一方面，與其他打印方法相比，擠出生物打印的分辨率稍差，對打印形狀和固定細胞位點的精確預置能力較低。常用的基礎打印工藝主要包括熔融沉積成型（FDM）、墨水直寫和近場直寫（MEW）。

圖2（a）噴墨打印和（b）擠出打印的示意圖。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有Elsevier Ltd。

光固化技術（SLA）是基于液體光敏樹脂的光聚合原理的工藝，即在紫外或者其他光源照射下液態(tài)光敏樹脂發(fā)生光聚合反應從而固化。當計算機控制的激光束在偏轉(zhuǎn)鏡的作用下掃描到樹脂液體表面時，光斑經(jīng)過的區(qū)域液體從點到面凝固。當?shù)谝粚訏呙柰瓿珊�，升降機驅(qū)動平臺下降一層高度，然后掃描下一層，直到得到一個完整的3D實體。因此，SLA是一個相對緩慢的打印過程（圖3a）。使用SLA技術可以構建具有明確定義的微觀結構和互連孔隙的組織工程支架。與基于噴墨和擠出的打印相比，SLA不存在噴嘴堵塞的問題，因此擴大了生物墨水粘度和細胞密度的范圍。但細胞活力將受到SLA工藝要求的顯著影響，即生物墨水須與光源兼容。此外，在SLA工藝中，用于交聯(lián)水凝膠的摻入光引發(fā)劑引起的材料毒性也是該技術在生物打印中應用的主要挑戰(zhàn)之一。因此需要對生物相容性打印墨水進行更多的研究，以提高SLA在臨床相關神經(jīng)組織工程結構中的應用。

面投影技術（DLP）也是基于樹脂材料的光聚合反應，不同于SLA的自下而上，DLP是一種自上而下的方法。DLP和SLA工藝的主要區(qū)別在于SLA可以投射激光束的光斑，而在DLP系統(tǒng)中由數(shù)百萬面鏡子組成的數(shù)字微鏡裝置（DMD）可以直接將二維的平面圖像投射到光敏材料的平面，從而大大提高了打印效率（圖3b）。盡管DLP有很多的優(yōu)勢，但是適用于神經(jīng)組織工程的打印材料還有待開發(fā)。

圖3（a）立體光固化和（b）面投影技術的示意圖。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2012) Elsevier Ltd。

3.2. 3D打印在周圍神經(jīng)和脊髓損傷修復中的應用
3D打印功能性支架誘導神經(jīng)分化
在使用3D打印技術構建神經(jīng)支架的過程中，可以預先設計打印墨水的物理和生物化學性質(zhì)以及形成的支架結構，以獲得可以引導神經(jīng)分化的功能性支架�？紤]到神經(jīng)組織的電生理特性，許多研究使用3D打印技術來制備導電支架。圖4總結了多種用于誘導神經(jīng)分化的3D打印功能性支架的方法和效果。

圖4（a–c）用于培養(yǎng)PC12細胞的導電PPy/膠原基底示意圖，以及噴墨打印的PPy直線和在導電支架上生長的PC12細胞的圖像。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2012) Elsevier B.V。（d–f）用于引導神經(jīng)細胞定向生長的3D打印功能化納米復合材料示意圖，以及分別在純PCL膜和CNF基復合材料上培養(yǎng)的神經(jīng)細胞行為的圖像。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有Royal Society of Chemistry。（g–j）3D導電神經(jīng)支架的示意圖，以及電刺激作用下3D打印支架中DRG細胞的行為和功能。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2019) Elsevier B.V。（k–m）光刺激響應的3D打印支架示意圖，以及支架多孔結構和NSCs在有/無光刺激作用下第14天的神經(jīng)元分化圖像。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2017) IOP Publishing Ltd。

3D打印神經(jīng)引導導管用于周圍神經(jīng)修復
大量研究證明，神經(jīng)引導導管（NGCs）作為一種組織工程植入物，在PNI修復中具有廣闊的應用前景。然而，現(xiàn)有的NGCs存在許多挑戰(zhàn)，如復雜的制造過程、簡單的體系結構以及缺乏有效的指導信號。作為一種快速成型技術，3D打印可以輕松快速地構建所需的結構，以模擬神經(jīng)組織的宏觀和微觀結構。作者總結了四類促進周圍神經(jīng)修復和再生的3D打印NGCs，包括能夠改善微環(huán)境的各向異性NGCs、增強神經(jīng)再生的藥物遞送NGCs、加速臨床應用的個性化NGCs和輔助神經(jīng)縫合術的特殊設計NGCs。圖5和圖6分別總結了3D打印制造各向異性NGCs和個性化NGCs的方法和效果。

圖5（a–e）模擬PNI微環(huán)境的3D打印多尺度NGC的示意圖，仿生支架及NGC的結構，以及外周神經(jīng)再生的體外和體內(nèi)研究結果。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2021) Wiley-VCH GmbH。（f–m）用可見光催化的功能化3D生物活性NGC的示意圖，3D打印支架和NGC的各向異性結構，以及對PC12細胞行為的指導作用。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2020) Elsevier Ltd。

圖6（a–f）DLP打印的具有多通道結構的NGCs以及對NCSCs分化和功能的影響。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2020) Elsevier Ltd。（g–m）個性化定制的3D打印NGCs以及坐骨神經(jīng)損傷的體內(nèi)研究。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2018) Elsevier Ltd。

3D打印結構促進脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡建立
細胞的精確空間排列對組織的功能性生長至關重要。由于脊髓包含一系列具有各種組織形態(tài)的細胞類型，這一點尤為重要。另外，精確的時空形態(tài)發(fā)生梯度產(chǎn)生特定的基因表達模式并控制神經(jīng)前體細胞（NPCs）的增殖和分化，是驅(qū)動脊髓中具有不同功能的不同細胞群的原因。3D打印技術在構建具有精確空間組織的多細胞神經(jīng)組織和具有分子濃度梯度的支架方面具有可行性，可以促進脊髓網(wǎng)絡的建立。圖7總結了3D打印結構促進脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡建立的方法和效果。

圖7（a–i）負載sNPCs和OPCs的3D打印生物相容性脊髓支架的構建以及用于SCI修復的體外研究。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2018) WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim。（j–n）3D打印支架的示意圖以及脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡形成的體外研究。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有Wiley-VCH GmbH。

3D打印脊髓樣支架用于SCI修復
3D打印為脊髓損傷修復提供了各種可行的解決方案，使用不同的生物墨水材料并結合不同的成分（如細胞、生長因子和生物分子）來促進脊髓再生�？梢源蛴∮缮�物材料、活細胞和/或生物活性因子組成的生物墨水，通過精確調(diào)節(jié)生物墨水中各成分的比例和打印條件，可以更好地模擬組織或器官的生理結構、機械性能和生物功能，最終實現(xiàn)損傷組織/器官的精確制造和快速修復。圖8總結了3D生物打印支架改善干細胞治療并促進SCI修復的方法和效果。

圖8（a–f）負載NSCs的生物打印脊髓樣支架的示意圖，以及植入12周后SCI修復的體內(nèi)研究。（d）中的GFP（綠色）和Tuj1（紅色）、（e）中的GFP（綠色）和NF（紅色）以及（f）中的GFP（綠色）和Oligo2（紅色）的免疫染色分別顯示了病變區(qū)域中植入的神經(jīng)干細胞的存活和神經(jīng)分化、成熟神經(jīng)元的形成以及少突膠質(zhì)細胞的分化。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2021) Elsevier Ltd。（g–m）負載NSCs和OSMI-4的3D打印SM水凝膠支架（SM-OSMI-4 + NSCs）的示意圖，以及SCI修復的體外和體內(nèi)研究結果。（j）中的活/死染色顯示培養(yǎng)7天后，3D生物打印支架中NSCs的存活情況。（k）中的GFAP（綠色）和Tuj1（紅色）、（l）中的NF（紅色）和（m）中的GAP43（紅色）的免疫熒光染色顯示了植入兩個月后SM-OSMI-4 + NSCs組病變區(qū)域的神經(jīng)絲再生和軸突再生情況。經(jīng)許可轉(zhuǎn)載，版權所有(2022) Elsevier Ltd。

未來展望
3D打印技術的快速發(fā)展和持續(xù)創(chuàng)新打破了傳統(tǒng)技術在制造先進神經(jīng)組織工程支架方面的局限性，可以構建復雜的神經(jīng)支架。然而，未來仍面臨一些挑戰(zhàn)：
（1）天然周圍神經(jīng)具有多尺度的層次結構，3D打印支架有望準確模擬周圍神經(jīng)的結構。但大多數(shù)基于擠出的3D打印支架只能在低水平上模擬分層結構，并且打印分辨率有限。因此，應該開發(fā)更復雜的微擠壓噴嘴，以實現(xiàn)具有更高分辨率的神經(jīng)支架的制造，甚至實現(xiàn)多尺度3D打�。�
（2）神經(jīng)元的細胞體和軸突分別組成天然脊髓的灰質(zhì)和白質(zhì)，呈現(xiàn)出具有多種功能的異質(zhì)結構。然而，具有各種功能的集成的脊髓支架很難制造。因此，應采用優(yōu)化的3D打印策略來構建具有復雜特征的定制支架，以實現(xiàn)多組分3D打��；
（3）在長距離PNI中，由于缺乏足夠的生化信號引導，即使引入了NGCs，受傷的神經(jīng)也很難跨越鴻溝再生。因此，應該開發(fā)更卓越的3D打印技術，通過在打印過程中原位結合所需的生物化學信號來“縮短”神經(jīng)損傷的距離；
（4）有效的電信號傳導對神經(jīng)再生至關重要，但目前3D打印支架中使用的導電/壓電材料是不可降解的。因此，有必要開發(fā)新型的、生物相容的可打印材料；
（5）提供具有足夠血管化的支架以便在神經(jīng)再生過程中輸送足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)是至關重要的，但很少有支架是專門制造用以實現(xiàn)具有必要血管化的神經(jīng)再生。因此，為了構建神經(jīng)再生增強和血管生成增強的支架，需要適當?shù)牟呗�，例如血管生長因子的控制釋放和支架中血管樣通道的建立。圖9總結了3D打印神經(jīng)支架的挑戰(zhàn)與前景。

圖9 3D打印神經(jīng)支架的挑戰(zhàn)與前景。