《Small》：基于雙光子技術(shù)構(gòu)建金字塔支架用于膠質(zhì)瘤培養(yǎng)

來(lái)源：EngineeringForLife

膠質(zhì)瘤是一類(lèi)常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，患者預(yù)后較差，生存率低下。目前，對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療尚無(wú)有效辦法，其中重要的原因是現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)手段難以保留膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)微環(huán)境下的特征，進(jìn)而限制了對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

微管形成的網(wǎng)絡(luò)骨架和表皮生長(zhǎng)因子受體（EFGR）在膠質(zhì)瘤侵襲中具有重要作用，但是隨著細(xì)胞在二維環(huán)境中增殖傳代，EGFR復(fù)制和微管形成均受到抑制。三維培養(yǎng)更接近真實(shí)的體內(nèi)微環(huán)境，而有利于追蹤、檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)行為。

來(lái)自荷蘭代爾夫特理工大學(xué)Angelo Accardo教授團(tuán)隊(duì)使用雙光子聚合技術(shù)（2PP）構(gòu)建了一種新型的三維支架，可模擬體內(nèi)微環(huán)境用于培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

相關(guān)研究成果近日以題為“3D-Engineered Scaffolds to Study Microtubes and Localization of Epidermal Growth Factor Receptor in Patient-Derived Glioma Cells” 發(fā)表在《Small》上。

1. 三維支架的制備
支架的設(shè)計(jì)借鑒了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境。膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)易在血管分支處增殖、遷移、聚集。因此，作者設(shè)計(jì)了一種與血管網(wǎng)絡(luò)相似的多孔結(jié)構(gòu)。作者使用2PP技術(shù)進(jìn)行支架制備，支架的基本單元為立方體（50μm），中間伴有一個(gè)斜行連接桿，數(shù)個(gè)小的立方體再堆積形成一個(gè)金字塔結(jié)構(gòu)（370μmx370μmx190μm）?？障兜拇笮∫舐源笥诩?xì)胞核從而能促進(jìn)細(xì)胞的遷移和物質(zhì)運(yùn)輸，同時(shí)有利于形成蜂窩狀結(jié)構(gòu)。

圖1 三維支架的制備

2. 三維支架上細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)
使用Tublin標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（U-87）和四種患者來(lái)源的膠質(zhì)瘤細(xì)胞（GS-580, GS-827, GS-830, 和GS-921）均可成功定植在支架上。掃描電鏡顯示，定植的細(xì)胞可形成長(zhǎng)突觸，并向立方體中央延伸。相比于二維環(huán)境，定植在三維支架上的細(xì)胞面積和細(xì)胞核面積均明顯減小，而細(xì)胞圓度兩者未見(jiàn)明顯差異。進(jìn)一步對(duì)6個(gè)膠質(zhì)瘤樣本中的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量分析發(fā)現(xiàn)，組織樣本和三維支架上的細(xì)胞核大小以及細(xì)胞核圓度均小于二維環(huán)境培養(yǎng)下的細(xì)胞核。因此，三維支架上培養(yǎng)的細(xì)胞在形態(tài)與結(jié)構(gòu)上更接近于體內(nèi)情況。

圖2 三維支架上的細(xì)胞形態(tài)

3. 三維支架上細(xì)胞微管形態(tài)和EGFR分布
微管是細(xì)長(zhǎng)的細(xì)胞突起，可以形成功能性蜂窩網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)于促進(jìn)腫瘤侵襲具有重要作用。

三維支架上的細(xì)胞可見(jiàn)長(zhǎng)而多的細(xì)胞突起，且在納米層面可見(jiàn)。進(jìn)一步使用GAP-43標(biāo)記微管蛋白，研究顯示，相比于二維培養(yǎng)，三維支架中的微管更短，更細(xì)。

EGFR是膠質(zhì)瘤中常見(jiàn)的受體之一，進(jìn)一步分析細(xì)胞EGFR的分布情況發(fā)現(xiàn)，EGFR在細(xì)胞中呈點(diǎn)狀分布并且靠近細(xì)胞核。甚至在三維支架培養(yǎng)的細(xì)胞中還分布于細(xì)胞突起。整體而言，EGFR在細(xì)胞中的分布在二維與三維培養(yǎng)下未見(jiàn)明顯差別。

圖3 三維支架上細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)和EGFR分布

4. 三維支架上細(xì)胞遷移特點(diǎn)
使用共聚焦活細(xì)胞成像在16.5h內(nèi)追蹤細(xì)胞的移動(dòng)軌跡，細(xì)胞在三維支架中的遷移速度僅為二維培養(yǎng)中的1/2，并且沿支架遷移，這與體內(nèi)遷移模式更加接近。而二維培養(yǎng)細(xì)胞遷移的方向更加隨機(jī)。

圖4 活細(xì)胞追蹤細(xì)胞在三維支架上的遷移情況

綜上，作者利用2PP技術(shù)制備了“金字塔結(jié)構(gòu)”的三維微支架，可成功用于培養(yǎng)人來(lái)源的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。并且，該支架培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞保留了體內(nèi)組織的特征，可用于體外研究細(xì)胞相互作用以及細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用。為膠質(zhì)瘤相關(guān)研究提供了一種全新而可靠的研究模型。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1002/smll.202204485