3D打印纖連蛋白材料支架

來源：EngineeringForLife

纖連蛋白（Fn）是正常組織中含量最多的ECM蛋白。Fn表達的上升與多種癌癥有關。例如在乳腺癌惡化的過程中，纖維纖連蛋白（fFn）會促進腫瘤的生成和遷移，一方面是因為惡性細胞中發(fā)生了上皮間質轉化（EMT）。除此以外，F(xiàn)n含量上調被認定為是癌癥轉移壁龕形成前的重要一步。Fn作為一種機械敏感性蛋白，當溶解在血漿中時總以比較緊湊聚集的狀態(tài)存在，而當存在于ECM中時（例如fFn）則處于各種各樣的拉伸狀態(tài)。Fn的結構則決定了影響其生物功能和細胞響應的結合位點是裸露還是隱蔽。Fn的原纖維生成需要通過力學遷移綁定在細胞表面受體上的整合素，來解構蛋白。而從結構角度來說，這一解構過程大部分發(fā)生在I型位點（Fn-3），這一區(qū)域會暴露自締合位點來促成隨后的原纖維生成。然而多年以來，人們依舊無法完全弄清Fn的I,II,III型位點是如何相互以及與細胞作用，從而形成原纖維的。除此以外，如何生成穩(wěn)定有效的fFn纖維網絡也是一個難點。雖然之前有很多研究實現(xiàn)了無細胞的生成Fn網絡，但是這些方法通常在應用到細胞培養(yǎng)和分析時，往往缺乏以下四個特點：i)有效的細胞滲入和去除能力ii)足夠透明易于觀察iii)為細胞沉積基質或者黏附提供一個支撐iv)足夠大面積的沒有合成材料的3D空間。

纖連蛋白（Fn）作為一種尤為重要的細胞外基質（ECM）蛋白，常常在2維或者3維的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，被用為涂層來創(chuàng)造一個能夠支持細胞存活的環(huán)境。但是，這些蛋白涂層的涂覆方式都和體內細胞沉積出來的用來組成ECM的Fn網絡的結構和功能不一致。近期，來自密西根大學的Joerg Lahann教授團隊在Advanced Materials雜志上發(fā)表了題為Engineered Fibrillar Fibronectin Networks as Three-Dimensional Tissue Scaffolds的文章，報道了一種用網格狀聚合物支架支撐，無細胞，力學性能好，且尺度可控的3維纖維纖連蛋白（fFn）網絡。作者通過在空氣，F(xiàn)n溶液和網格支架的3相交界處，通過水動力誘導的方式，可以形成十分穩(wěn)定的fFn網絡。該fFn網絡可以促進細胞的滲透和增殖，并可體外擴增原代癌細胞，誘導其間質轉化。未來，該人造fFn網絡有望應用于基礎細胞研究，精準醫(yī)療，藥物測試和臨床前診斷。

圖1. 水動力誘導Fn原纖維生成

作者利用支架輕微剪切Fn溶液（角速度8轉/分鐘），在空氣，F(xiàn)n溶液和支架三相接觸部位產生非溶液狀態(tài)的fFn網絡，整個過程沒有使用變性劑（圖1）。支架利用3D jet writing[2]方法打印PLGA獲得，帶有500x500um方形孔，厚度120um，可為細胞的滲透和生長提供更大體積的懸浮蛋白基質。所制造出的fFn網絡與人類纖維母細胞沉積的基質的形態(tài)類似。

圖2. fFn網絡在老鼠乳腺癌模型中提升腫瘤移植效率

由于Fn為原發(fā)性乳腺癌細胞外基質的主要成分，作者測試了fFn網絡在老鼠乳腺癌模型中提升腫瘤移植效率的能力（圖2）。首先，作者在支架上培養(yǎng)了AT-3小鼠乳腺癌細胞，這種細胞會在fFn網絡上穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶。隨后，帶著30000細胞的fFn支架被植入免疫活性C57BL/6老鼠。生物放光成像圖片顯示，在支架中，初始的腫瘤生成信號在植入后兩天便出現(xiàn)。相反，在細胞懸液中經過21天也未曾出現(xiàn)腫瘤移植。移植腫瘤的組織學圖片顯示，癌細胞經過fFn網絡侵入了周圍組織。增長的致瘤性與體外測試結果一致，fFn網絡中的AT-3細胞增加了腫瘤初始亞群（CD29+/CD24+）和轉移（CD29+/CD24+/CD90.2+）。

圖3. fFn網絡增加MDA-MB-468人類乳腺癌細胞的腫瘤初始細胞量

隨后，作者又測試了fFn網絡在人類三陰性乳腺癌細胞中是否也會增加致瘤性。選用了MDA-MB-468細胞系列（圖3）。四天的擴增之后，MDA-MB-468細胞形成了擴展面積達到10平方毫米的致密3D癌癥微環(huán)境。與培養(yǎng)在組織培養(yǎng)聚苯乙烯（TCPS）上，和Fn涂覆的TCPS上的細胞相比，fFn網絡上的CD44+/CD24−亞群顯著高于前兩者。除此以外，在所有時間點上，fFn網絡上的CD44+/CD24−/ALDH+亞群也是顯著高于控制組的。MDA-MB-468細胞培養(yǎng)4天之后，fFn網絡被去細胞化并且針對Fn和層連蛋白共染色。結果證明MDA-MB-468細胞只是分泌了少量的層連蛋白，而原本的fFn網絡還是保存完好。證明Fn是早期上皮間質轉化的主要ECM因素。

圖4. fFn網絡擴增病人乳腺癌細胞

最后，作者測試了利用fFn網絡直接擴增病人乳腺癌細胞的能力，結果顯示8天的時候，fFn支架的擴增數(shù)量比對照組高出7倍，且fFn支架可以在體外誘導乳腺癌病人細胞的上皮間質轉化。

圖5. 3D jet writing

文章中的網格狀聚合物支架由Joerg Lahann教授團隊之前提出的3D Jet Writing工藝制造，相關文章于2018年發(fā)表在Advanced Materials雜志上，題為3D jet writing: functional microtissues based ontessellated scaffold architectures。該工藝的優(yōu)勢在于可以3維高精度地沉積聚合物纖維，且不需要像溶體電紡那樣高溫加熱，為載細胞的高精度電紡打印打下基礎。其特點在于在打印噴頭的底部安裝了一個副電極，抑制了纖維在沉積過程中的不穩(wěn)定，從而可以實現(xiàn)高重復精度的打印。

參考文獻：
[1] Jordahl S, Solorio L, Neale D B, et al. Engineered Fibrillar Fibronectin Networks as Three‐Dimensional Tissue Scaffolds[J]. Advanced Materials, 2019, 31(46): 1904580.
[2] Jordahl J H, Solorio L, Sun H, et al. 3D jet writing: functional microtissues based on tessellated scaffold architectures[J]. Advanced Materials, 2018, 30(14): 1707196.