哈佛大學(xué)| 明膠纖維引導(dǎo)3D打印心室中的心肌細(xì)胞排列

來源： GK綠鑰生物科技

美國(guó)哈佛大學(xué)Kevin Kit Parker教授團(tuán)隊(duì)在《Nature Materials》期刊發(fā)表論文“Fibre-infused gel scaffolds guide cardiomyocyte alignment in 3D-printed ventricles”，開發(fā)了一種含有預(yù)制明膠纖維的水凝膠墨水，用于打印3D器官級(jí)支架，再現(xiàn)心臟的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間組織。作者通過將預(yù)制明膠纖維添加到水凝膠中可以控制墨水流變性，實(shí)現(xiàn)受控的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，以實(shí)現(xiàn)獨(dú)立3D結(jié)構(gòu)的精確打印，而無需額外的支撐材料。在墨水?dāng)D壓過程中，剪切誘導(dǎo)的纖維排列提供了微尺度的幾何線索，促進(jìn)了體外培養(yǎng)的人類心肌細(xì)胞向各向異性肌肉組織的自組織，3D打印心室體外模型具有仿生各向異性電生理和收縮特性。

WHAT——什么是明膠纖維？

明膠纖維是一種合成纖維，通常由明膠為原料制成，可以與天然的膠原纖維相媲美，其尺寸通常在1.3 μm到8.7 μm之間，這種纖維具有較好的力學(xué)性能，并且與某些細(xì)胞具有良好的相容性。明膠纖維與纖維表面的相互作用原理包括物理和化學(xué)相互作用，能增加纖維之間的接觸面積，提高結(jié)合的強(qiáng)度。
WHY——為什么要用生物3D打印的方法來制造心臟組織？

目前研究人員更多是通過微接觸印刷、光刻、定向冷凍干燥、纖維紡絲和微生理芯片制造來設(shè)計(jì)心臟組織，但這些方法在制造完全復(fù)制心臟功能的復(fù)雜幾何組織的能力方面受到限制。而生物3D打印的優(yōu)勢(shì)就在于能夠制造復(fù)雜、生物相容性更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)，可以精確地復(fù)制細(xì)胞和組織的原始結(jié)構(gòu)。
HOW——作者通過將明膠纖維注入明膠和海藻酸鹽(Gel-Alg)水凝膠基質(zhì)來設(shè)計(jì)墨水。

圖1 開發(fā)打印具有細(xì)胞對(duì)齊線索的獨(dú)立式3D打印組織支架的明膠墨水

將纖維融入水凝膠中可以改變墨水的流變性，從而無需任何支撐結(jié)構(gòu)或材料即可創(chuàng)建精確且復(fù)雜的3D支架。通過排列明膠微纖維的形式，結(jié)合拓?fù)浜突瘜W(xué)線索來打印的3D心室支架能促進(jìn)心肌細(xì)胞自組織成各向異性肌肉組織。在制造纖維注入凝膠(FIG)墨水后，作者打印了由明膠纖維和Gel-Alg水凝膠組成的3D支架。在打印過程中，噴嘴內(nèi)的剪切應(yīng)力足以使具有彈性的FIG墨水變成液體，擠壓后恢復(fù)其彈性穩(wěn)定性。這些非線性流變特性允許FIG墨水連續(xù)擠壓，還能夠打印復(fù)雜的幾何形狀的分層結(jié)構(gòu)，且無需犧牲層或犧牲浴作為支撐結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)自我支撐的空心3D結(jié)構(gòu)?？傊z狀FIG墨水的高彈性模量提供了足夠的凝膠穩(wěn)定性，可以打印厚度在200 μm到350 μm之間的自支撐壁，而不需要支架或犧牲浴。

圖2 在明膠纖維灌注凝膠的打印支架上，培養(yǎng)心臟組織的各向異性細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間組織

為了評(píng)估FIG墨水打印支架在增強(qiáng)心肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間組織、肌原纖維組織和排列的能力，作者將新生大鼠心室心肌細(xì)胞（NRVM）接種在打印的二維（2D）FIG支架上。結(jié)果得到高度排列的心臟組織的形成，相對(duì)于多形性培養(yǎng)條件保留了相當(dāng)?shù)募?xì)胞活力。接下來作者通過計(jì)算取向順序參數(shù)(OOP)來測(cè)量結(jié)構(gòu)組織的各向異性程度，該參數(shù)量化了肌聚體 α-肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白絲(F -肌動(dòng)蛋白)排列。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間骨架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的預(yù)應(yīng)力決定了細(xì)胞核的伸長(zhǎng)和取向，與對(duì)照Gel-Alg支架上的細(xì)胞核相比，F(xiàn)IG支架上的細(xì)胞核被拉長(zhǎng)，NRVM的核取向也沿打印方向排列(0°)，而Gel-Alg支架的核取向無特異性取向。

圖3 多向各向異性心臟組織的機(jī)電耦合動(dòng)力學(xué)

為了測(cè)試FIGs誘導(dǎo)心肌細(xì)胞沿纖維結(jié)構(gòu)自組織并形成心臟功能合胞體的能力，作者測(cè)量細(xì)胞-細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)的功能后果及其電生理特性。作者使用光學(xué)作圖來測(cè)量鈣(Ca2+)瞬態(tài)傳播，作為相對(duì)于打印方向沿縱向和橫向軸的心臟脈沖傳導(dǎo)的指標(biāo)。最后結(jié)果表明，F(xiàn)IG支架上的心臟組織在6厘米的蛇形圖案上傳播Ca2+波，顯示出沿打印方向的強(qiáng)大電耦合。利用NRVM和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞(hiPSC-CMs)在FIG支架上構(gòu)建心臟組織的橫縱傳播速度值分別為1.67±0.085和1.62±0.18。相比之下，沒有纖維的對(duì)照支架上的NRVM組織的傳播速度比接近1。心肌細(xì)胞沿打印方向的優(yōu)先機(jī)電耦合使其在電刺激下產(chǎn)生循環(huán)變形，在一個(gè)支架中交替排列方向也表明心肌細(xì)胞組織遵循局部纖維方向，導(dǎo)致相應(yīng)的局部組織收縮模式。

圖4 基于人類干細(xì)胞的組織工程，三維心室模型的結(jié)構(gòu)、電生理和收縮特性

作者在3D打印的心室支架上培養(yǎng)NRVM和hiPSC-CMs，纖維呈圓周排列，形成三維心室形狀的層狀各向異性心臟組織。體外心室模型在培養(yǎng)中保持14天，自發(fā)心跳率為每秒~0.71次。這表明該支架在超過80萬次的機(jī)械載荷循環(huán)中是耐用的，沒有明顯的退化。作者在對(duì)NRVM培養(yǎng)的腦室模型進(jìn)行點(diǎn)電刺激后，觀察到Ca2+在橫向(打印方向)的瞬時(shí)傳播速度比縱向更快。這證實(shí)了3D打印腦室支架中的脈沖傳播也沿著組織排列發(fā)生，這是由打印方向決定的。為了評(píng)估hiPSC-CM心室模型的收縮性能，作者使用粒子成像測(cè)速 (PIV) 測(cè)量了基底開口處的流體動(dòng)力學(xué)輸出，粒子流的方向和速度使能夠估計(jì)收縮和松弛期間流體運(yùn)動(dòng)的質(zhì)量通量。最后計(jì)算出hiPSC-CM 培養(yǎng)心室模型的心室容積在峰值收縮和峰值舒張之間的變化為5.94±1.66%，比先前報(bào)道的NRVM和hiPSC-CM體外心室模型的數(shù)值(射血分?jǐn)?shù))分別高出2-5倍和8-20倍。

結(jié)論：作者展示了用基于水凝膠的FIG墨水3D打印組織工程心室模型的能力，該模型同時(shí)再現(xiàn)了心臟的微結(jié)構(gòu)ECM結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)器官水平幾何形狀。注入明膠纖維在水凝膠墨水中充當(dāng)流變改性劑，能夠在不使用犧牲浴的情況下打印復(fù)雜的3D物體。這些纖維還提供生化和微觀結(jié)構(gòu)線索，促進(jìn)細(xì)胞粘附和自組織成為功能性合胞體。這項(xiàng)工作表明FIG墨水打印將在促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化和可訪問的生物打印過程中發(fā)揮重要作用，以微結(jié)構(gòu)精度再現(xiàn)天然器官幾何形狀。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41563-023-01611-3